基于CRISPR/Cas9技術創制木薯MeSTP7和MeSTP15雙基因突變體
2022-03-25 22:38:30耿沙張建禹王曉彤任思楊毋志浩姚遠李瑞梅
熱帶作物學報 2022年3期
耿沙 張建禹 王曉彤 任思楊 毋志浩 姚遠 李瑞梅
，
郭建春，劉? 姣，羅麗娟
1. 海南大學熱帶作物學院，海南海口? 570228;2. 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所/海南熱帶農業資源研究院，海南海口? 571101
摘? 要：木薯（ Crantz）是一種熱帶、亞熱帶重要的糧食與能源作物，提高木薯的產量對木薯產業發展至關重要。木薯塊根的發育直接影響其產量情況，而不同逆境脅迫會影響木薯塊根的發育情況。因此解析木薯塊根的發育機制有助于通過分子育種手段實現木薯高產，以及獲得具備一定抗逆品質的優良種質，增強木薯的適應性，從而擴大木薯種植的推廣面積。己糖轉運蛋白（STPs）是一類MSTs亞家族蛋白，通過轉運糖類物質調節植物生長發育及非生物脅迫。本實驗室前期鑒定出和基因在塊根發育時期的糖分累積、應對非生物脅迫過程中起到重要作用，因此獲得木薯和雙突變體將有助于解析木薯塊根發育機制及創制抗逆新種質。為了得到和木薯雙突變體，利用在線軟件CRISPR-P v2.0同時設計靶標基因和的sgRNA，成功構建了和的CRISPR/Cas9雙基因編輯載體。將編輯載體轉化農桿菌LBA4404后，侵染‘華南8號’（SC8）木薯脆性胚性愈傷組織，經過Sanger測序分析和成功發生編輯，而潛在的脫靶位點未發生編輯，說明雙編輯載體可對和基因進行編輯，且不造成脫靶現象，然后將侵染后的脆性胚性愈傷組織誘導出子葉，經過15?mmol/L的潮霉素B篩選出生根植株，生根植株再經過分子檢測，成功獲得帶有雙編輯載體表達框的轉基因陽性植株。以陽性植株的基因組作為模板，分別用PCR擴增2個基因的靶位點前后各100 bp核苷酸序列，經過Hi-TOM測序后，結果顯示有26個株系發生突變，其中雙基因突變體有23個，單基因突變體2個，單基因突變體1個，編輯類型多為單堿基缺失或插入，大片段堿基的缺失所占比率小。初步在組培瓶中觀察突變體的變型，發現單突變體和雙突變體的根系生長均受抑制，植株矮小，且和雙突變體受損更嚴重。該研究結果不僅為進一步解析木薯塊根發育機制奠定基礎，還為獲得木薯抗病、抗逆新種質提供材料。
關鍵詞：木薯;己糖轉運蛋白;CRISPR/Cas9;雙基因編輯
中圖分類號：S330 文獻標識碼：A
Construction of and Double Mutants in Cassava Based on CRISPR/Cas9 Technology
GENG Sha， ZHANG Jianyu， WANG Xiaotong， REN Siyang， WU Zhihao， YAO Yuan， LI Ruimei， GUO Jianchun， LIU Jiao， LUO Lijuan
1. College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Hainan Institute for Tropical Agricultural Resources， Haikou， Hainan 571101， China
Cassava （ Crantz） is an important food and energy crop in the tropics and subtropics， and improving cassava production is essential for the development of the cassava industry. The development of cassava storage root directly affects its yield， and different adversity stresses can affect the development of cassava storage root. Therefore， the analysis of cassava storage root development mechanism can help to achieve high cassava yield through molecular breeding， as well as to obtain excellent germplasm with certain resistance quality and enhance the adaptability of cassava， so as to expand the extension of cassava cultivation. Hexose transport proteins （STPs） are a subfamily of MSTs that regulate plant growth and development as well as abiotic stresses by transporting sugars. The and genes have been identified to play an important role in sugar accumulation during tuber development and in response to abiotic stresses. To obtain cassava double mutants， CRISPR/Cas9 double gene editing vectors for and were successfully constructed by designing the sgRNAs of both target genes， and 5， using the online software CRISPR-P v2.0. After transformation of the editing vector into LBA4404， ‘SC8’ cassava brittle embryonic healing tissues were infiltrated， and and were successfully edited by Sanger sequencing analysis， while the potential off-target sites were not edited， indicating that the dual editing vector could edit both and genes without causing off-target phenomenon. The rooted seedlings were then screened with 15 mmol/L Hygromycin B to produce rooted seedlings， which were then characterized detection to obtain positive transgenic cassavaplantswith the expression frame of the double-edited vector. The genomes of positive plants were used as the templates for PCR amplification of 100 bp nucleotide sequences before and after each target site of the two genes， and after Hi-TOM sequencing， the results showed that there were 26 strains with mutations， including 23 double mutants， 2 single mutants and 1 single mutant， and the editing types were mostly single. The types of editing were mostly single base deletions or insertions， with a small percentage of deletions of large segments of bases. Our preliminary observations of the mutant variants in histoponic flasks revealed that root growth was inhibited and plants were dwarfed in both the single and double mutants， and that the and double mutants were more severely damaged. These results not only lay the foundation for further analysis of the mechanism of cassava tuber development， but also provide material for obtaining new germplasm for cassava disease and stress resistance.
cassava; hexose transport proteins; CRISPR/Cas9; double gene editing
10.3969/j.issn.1000-2561.2022.03.004
木薯（ Crantz）是一種熱帶、亞熱帶重要的糧食與能源作物。木薯產量與其塊根發育和逆境適應密切相關。在植物中，單糖可作為植物生命活動的能量供給，還可作為信號分子與激素協同作用、滲透保護劑、抗氧化劑等影響植物的生長發育。而糖類物質的運輸由糖外排轉運蛋白（SWEETs）、蔗糖轉運蛋白（SUTs）、單糖轉運蛋白（MSTs）三類蛋白負責運輸。己糖轉運蛋白（STPs）屬于MSTs亞家族，具有典型的12次跨膜結構域，是質膜上H/糖共轉體，不同的己糖轉運蛋白STPs具有的氨基端和羧基端跨膜蛋白序列有很高的同源性，但在一些結構域有保守的氨基酸序列，其功能并不一致。研究表明STPs主要參與植物庫器官的發育和庫強的構建，還參與植物的開花結果、信號傳導、生物和非生物脅迫等多種生理過程。為研究在木薯塊根發育和非生物脅迫中的作用，本實驗室前期在木薯中成功鑒定出20個己糖轉運蛋白基因。對其組織特異性和木薯塊根發育過程中的表達模式分析，發現其中（Manes.03G180400）和（Manes. 15G027300）在早期貯藏根的根尖中高表達，且受干旱脅迫和低溫脅迫誘導表達上調最高，推測和基因參與塊根發育時期的糖分累積和應對非生物脅迫過程中起到重要作用。此外，和有相似的糖轉運功能，對葡萄糖、戊糖、木糖、核糖、半乳糖、果糖和甘露糖這7種己糖都有轉運特性。
和的蛋白序列相近，功能可能存在冗余，為更好地解析這2個基因功能，對其同時進行基因編輯，創制和MeSTP15雙突變體。CRISPR/Cas9基因編輯技術不僅編輯效率高、穩定和特異性強，還能同時編輯多個基因，被廣泛地應用到醫學研究和生命科學領域，目前用于提高作物的抗性及營養價值，已在玉米、水稻、木薯等植物中應用。在木薯中，利用CRISPR/Cas9雙基因編輯技術同時介導編輯木薯eIF4E異構體nCBP-1和nCBP-2，可降低木薯褐條病癥狀嚴重程度和發病率，為本研究提供了設計提供了思路。本研究利用CRISPR/Cas9技術構建木薯和雙基因編輯載體，轉化‘華南8號’（SC8）木薯脆性胚性愈傷，驗證載體的編輯效果，獲得了和雙基因突變體，有助于后續深入解析在木薯塊根發育過程中的作用。
?材料與方法
? 材料
本研究選用具有適應性強、抗風性強、出苗率高的木薯品種‘華南8號’（SC8），種植于中國熱帶農業科學院木-薯種質資源圃。菌株LBA4404根癌農桿菌菌株、DH5α大腸桿菌菌株購于上海唯地生物技術有限公司，載體質粒pCAMBIA1301-Cas9-sgRNA為本實驗室所保存。
? 方法
1.2.1? 靶點引物的設計及基因編輯載體構建根據（Manes.03G180400）和（Manes.15G027300）基因的CDS序列，利用CRISPR-P v2.0在線軟件（http：//crispr.hzau.edu. cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR）分析CDS區靶點及潛在脫靶位點，選擇滿足以下條件的靶點：靶點得分高于0.6，相對應脫靶位點得分低;靶點GC含量為50%～70%;sgRNA中至少含有完整的莖環RAR、莖環2、莖環3。合成靶點退火引物（表1），參照李嶄等的方法構建和雙基因編輯載體。根據載體序列，在AtU6-26啟動子前設計陽性克隆F，在gRNA2后設計陽性克隆R，通過菌液PCR擴增目的片段（538 bp），將測序正確的質粒命名為pCAMBIAP1301-Cas9- -sgRNA，并將該質粒轉化LBA4404農桿菌，菌液PCR驗證正確后備用。
1.2.2木薯脆性胚性愈傷組織的誘導及侵染轉化? 將鑒定正確的pCAMBIAP1301-Cas9-- sgRNA質粒的LBA4404農桿菌侵染木薯的脆性愈傷組織，將農桿菌搖菌至對數，調整侵染濃度為為0.65，乙酰丁香酮濃度為250 mmol/L，侵染時間為40?min。侵染后的脆性胚性愈傷組織轉移至GD固體培養基上，在22℃黑暗條件培養3?d后洗菌。然后移至GD固體培養基上，第1周不加潮霉素篩選，從第2周開始每周更換一次潮霉素篩選壓（5、8、15?mg/L潮霉素），培養4周后，移至培養基（MS+1?mg/L?NAA）誘導子葉，子葉在生根（MS+15?mg/L潮霉素）篩選后再經過DNA鑒定，確定陽性植株。
1.2.3? 編輯效果檢測及脫靶分析 ?根據張彤等的方法，設計和 ?CDS區編輯靶點和4個潛在脫靶位點區域的PCR擴增引物（表1）。提取未侵染的木薯脆性胚性愈傷組織DNA和含有pCAMBIAP1301-Cas9--sgRNA質粒農桿菌侵染后的木薯脆性胚性愈傷組織DNA，用靶點引物（target-1）和靶點引物（target-2）PCR擴增獲得目的片段并測序。基于Sanger測序峰值圖，分析編輯效果及驗證是否存在脫靶情況。
1.2.4? 陽性苗的鑒定及突變體的鑒定? 提取經過潮霉素生根篩選的再生植株葉片的DNA，用陽性克隆篩選引物，PCR擴增包含AtU6-26、靶點1、gRNA1、靶點2、gRNA2載體片段，凝膠電泳片段大小為538 bp的則為轉基因苗。提取陽性苗的DNA，用靶點引物（target-1）和 靶點引物（target-2）PCR擴增基因靶點前后100?bp，送高通量測序（Hi-TOM測序），檢測靶點是否發生插入或缺失，分析是否導致基因突變。
? 結果與分析
2.1 ?雙基因編輯靶點的設計及潛在脫靶位點分析
利用木薯基因和的DNA序列，通過在線設計軟件CRISPR-P2.0，獲得，基因編輯靶點位于該基因的第3個外顯子，命名靶點1（圖1），GC含量為60%，有1個潛在脫靶位點，位于10號染色體Manes. 10G030300基因的CDS區，脫靶分值為0.106，命名為Off-target-1;基因編輯靶點位于該基因的第2個外顯子，命名靶點2（圖1），GC含量為48%，有3個潛在脫靶位點，Off-target-2位于10號染色體Manes.10G105000基因的內含子，脫靶分值為0.312，Off-target-3位于號染色體Manes.08-G047800基因的內含子，脫靶分值為0.115，Off-target-4位于1號染色體Manes. 01G204800基因的內含子，脫靶分值為0.092。潛在脫靶位點只有Off-target-1位于CDS區且得分較低，其余脫靶位點位于內含子，表明即使脫靶也不會造成基因功能的缺失（表2）。對靶點1和靶點2的sgRNA的二級結構預測分析結果顯示，靶點序列二級結構較為松散，含有完整的莖環RAR、莖環2、莖環3，利于結合靶位點（圖2）。
?基因編輯載體構建
本研究所采用的基因編輯載體為pCAMBIA-1301-Cas9-sgRNA。利用限制性內切酶Ⅰ酶切將載體線性化，再將線性化的質粒與退火后的靶點引物連接，得到AtU6-26--sgRNA表達盒（圖3）。通過菌液PCR擴增目的條帶，經測序分析，長約538?bp，進一步證明載體pCAMBIA-1301-Cas9--sgRNA已構建成功。最后提取陽性質粒轉LBA4404農桿菌，備用。
?木薯脆性胚性愈傷組織的誘導及轉化
將培養2個月的‘SC8’無菌苗切莖段，誘導側芽膨大，挑取側芽誘導體細胞胚，體細胞胚誘導得到脆性胚性愈傷組織（圖4A、圖4B、圖4C）。將攜帶編輯質粒pCAMBIA1301-Cas9- -sgRNA的LBA4404農桿菌轉化木薯脆性胚性愈傷組織，轉化后培養脆性胚性愈傷組織4周，再誘導出子葉，誘導子葉分化形成植株，在MS+15?mg/L潮霉素的培養基中篩選再生根苗（圖4D、圖4E、圖4F）。
<！--[if gte vml 1]>
? 編輯效果檢測及脫靶分析
以未轉化和轉化4周后的脆性胚性愈傷組織
DNA為模板，通過PCR擴增和基因的編輯靶點上下100 bp左右的基因組片段，并測序分析該區域的序列變化情況。結果顯示，在轉化后的樣品中，靶點（Target-1）的PAM區附近開始出現多峰，靶點（Target-2）的PAM區及后續片段都發生了移碼，峰值錯亂，然而未轉化樣品中并無雜鋒出現（圖5），表明攜帶編輯質粒的農桿菌成功轉化進入脆性胚性愈傷組織，在2個靶點處發生編輯。再以未轉化和轉化4周后的木薯脆性胚性愈傷組織DNA為模板，通過PCR擴增和基因編輯靶點的4個潛在脫靶位點區域片段，利用Sanger測序分析該靶點是否存在脫靶現象。結果表明，潛在脫靶位點的序列在已轉化和未轉化的樣品中未發生改變（圖6）。說明本研究構建的雙基因編輯載體pCAMBI-A1301-Cas9-- sgRNA可對和基因同時進行編輯，均無脫靶現象。
?陽性苗篩選及突變體編輯分析
將鑒定發生編輯的木薯脆性胚性愈傷組織誘導產生子葉，子葉誘導成苗，經過15?mg/L的潮霉素生根篩選，提取生根苗的DNA進行PCR檢測，成功得到帶有編輯表達框的陽性植株（圖7）。陽性苗Hi-TOM測序檢測是否發生編輯，于‘SC8’比對分析，2個靶點的編輯類型主要是單個堿基的缺失或插入，大片段的編輯類型較少;突變類型有純和突變、雜合突變及雙等位突變的多種突變形式，編輯率比對發現，靶點Target-1<！--[if gte vml 1]>
突變體表型分析
突變體莖段培養一個月后，與野生型（SC8）相比，所有株系均表現出生長緩慢，植株矮小，根系生長受抑制。單突變體與的單基因突變體相比，株高稍高但根系發育相對緩慢;推測主要在根中發揮作用;而雙突變體、株系相比于野生型和單突變體，根系發育嚴重受損，植株低矮，葉片窄小。同時觀察到的根系受損比嚴重推測由于突變比率高于（圖8）。初步證明功能存在冗余，影響木薯根的發育。
<！--[if gte vml 1]>
討論
植物進行光合作用，在葉片中合成糖類物質，這些糖類物質從源葉組織經過糖轉運體運輸、轉運到下沉庫組織利用和儲存。這一過程對植物應對非生物脅迫和生物脅迫至關重要。因此，了解糖分配及其遺傳調控對于實現突破以提高作物產量和非生物脅迫耐受性至關重要。KOMAITIS等在蒺藜苜蓿中研究發現MSTs家族通過調控糖分的運輸，進而影響苜蓿根瘤菌對氮的固定。董元花在蘋果中發現過表達后，促進植株根的生長發育，同時抗逆性降低。擬南芥中，利用RNAi干擾沉默和后，切斷對保衛細胞的能量供應，抑制光合作用。定位于擬南芥側根結點處，和側根生長相關。過表達后增加擬南芥葉片光合作用，從而提高氮的利用率，并且能抑制灰霉病。在水稻中，、、、和在鹽、滲透性和干旱脅迫下高表達。在小麥中，小麥條銹病可刺激宿主細胞中的ABA生物合成，從而上調、和的表達，從而增加真菌己糖的供應，促進感染，在大麥中發現突變體（自然突變的），削弱了己糖轉運活性，對銹病和白粉病有一定的抗性，反義沉默也能抑制條銹病的感染。
CRISPR/Cas9是一項特異識別編輯技術，僅需gRNA引導序列和Cas9核酸酶即可對靶基因DN序列進行剪切編輯，CRISPR/Cas9雙基因編輯已經使用于多個物種。為研究和的生物學功能，利用CRISPR/Cas9技術分別設計和的靶位點，將2個靶位點串聯，構建雙基因編輯載體，轉化木薯胚性脆性愈傷組織，一個月后檢測靶點的編輯效率，證明本研究構建的雙基因編輯載體pCAMBIA-<！--[if gte vml 1]>
本研究通過構建CRISPR/Cas9介導的雙基因編輯載體，對和基因同時進行編輯。初步確定和對木薯根系發育的影響。為后續研究塊根發育機制提供了豐富的材料，而STPs家族在植物應對非生物脅迫和抗擊病原菌中也起到關鍵作用，推測突變體在應對非生物脅迫和抵抗病原菌起到作用。本研究對其功能分析尚淺，后續我們將在大田里篩選可穩定遺傳的株系作為研究材料，分析不同階段的木薯根系形態及地上部分的生長情況，檢測塊根淀粉和糖類物質含量，分析和基因其對植物生長發育的影響;對其突變體進行干旱、鹽和低溫脅迫并分析其抗逆性，解析和基因在非生物脅迫中的作用;接種木薯的主要病原菌：細菌性枯萎病、花葉病、褐斑病、銹病和白粉病，分析突變體對這些病害是否有抗病性。
參考文獻
[1]???? 嚴華兵， 葉劍秋， 李開綿. 中國木薯育種研究進展[J]. 中國農學通報， 2015， 31（15）： 63-70.
YAN H B， YE J Q， LI K M. Progress of cassava breeding in China[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2015， 31（15）： 63-70. （in Chinese）
[2]???? WAISUNDARA V. Cassava[M/OL]. IntechOpen： 2018. https：//www.intechopen.com/books/6308.
[3]???? SMEEKENS S， HELLMANN H A. Sugar sensing and signaling in plants[J]. Front Plant Science， 2014， 5： 113.
[4]???? RUAN Y L， JIN Y， YANG Y J， LI G J，?BOYER J S. Sugar input， metabolism， and signaling mediated by invertase： roles in development， yield potential， and response to drought and heat[J]. Molecular Plant， 2010， 3（6）： 942-955.
[5]???? JULIUS B T， LEACH K A， TRAN T M， MERTZ R A， BRAUN D M. Sugar transporters in plants： new insights and discoveries[J]. Plant and Cell Physiology， 2017， 58（9）： 1442-1460.
[6]???? BüTTNER M， SAUER N. Monosaccharide transporters in plants： structure， function and physiology[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 2000， 1465（1/2）： 263-274.
[7]???? SHERSON S M， ALFORD H L， FORBES S M， WALLACE G， SMITH S M. Roles of cell-wall invertases and monosaccharide transporters in the growth and development of [J]. Journal of Experimental Botany， 2003， 54（382）： 525-531.
[8]???? BüTTNER M. The monosaccharide transporter （-like） gene family in [J]. FEBS Letters， 2007， 581（12）： 2318-2324.
[9]???? BüTTNER M. The sugar transporter （AtSTP） family： an update[J]. Plant Biology， 2010， 12： 35-41.
[10]?? QIN L， HUIJIE D， ZHIJIAN C， DANG H J， CHEN Z J， WU J Z， CHEN Y H， CHEN S B， LUO L J. Genome-wide identification， expression， and functional analysis of the sugar transporter gene family in cassava （ Crantz）[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2018， 19（4）： 2-18.
[11]?? 黨會杰. 木薯單糖轉運蛋白基因、的克隆與功能初步分析[D]. 海口： 海南大學， 2018.
DANG H J. Cloning and functional analysis of ， sugar transporter gene in cassana （Crantz）[D]. Haikou： Hainan University， 2018. （in Chinese）
[12]?? 武軍政. 木薯己糖轉運蛋白基因的克隆與功能初步分析[D]. 海口： 海南大學， 2017.
WU J Z. Cloning and primary functional identification of sugar transporter gene in cassava （ Crantz）[D]. Haikou： Hainan University， 2017. （in Chinese）
[13]?? WANG J， CHEN H. A novel CRISPR/Cas9 system for efficiently generating Cas9-free multiplex mutants in [J]. aBIOTECH， 2019， 1（1）： 6-14.
[14]?? XIE K， MINKENBERG B， YANG Y. Boosting CRISPR/ Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2015， 112（11）： 3570-3575.
[15]?? ODIPIO J， ALICAI T， INGELBRECHT I， NUSINOW D A， BART R， TAYLOR N J. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing of in cassava[J]. Frontiers in Plant Science， 2017， 8（18）： 1780-1791.
[16]?? GOMEZ M A， LIN Z D， MOLL T， CHAUHAN R D， HAYDEN L， RENNINGER K， BEYENE G， TAYLOR N J， CARRINGTON J C， STASKAWICZ B J， BART R S. Simultaneous CRISPR/Cas9-mediated editing of cassava eIF 4E isoforms nCBP-1 and nCBP-2 reduces cassava brown streak disease symptom severity and incidence[J]. Plant Biotechnology Journal， 2019， 17（2）： 421-434.
[17]? 李? 嶄， 王亞杰， 陸小花， 李瑞梅， 劉? 姣， 符少萍， 胡新文， 郭建春， 姚? 遠. 木薯基因的CRISPR/ Cas9基因編輯載體構建及驗證[J]. 分子植物育種， 2020， 18（16）： 5367-5372.
LI Z， WANG Y J， LU X H， LI R M， LIU J， FU S P， HU X W， GUO J C， YAO Y. Construction and verification of CRISPR/ Cas9 gene editing vector for cassava gene[J]. Molecular Plant Breeding， 2020， 18（16）： 5367-5372. （in Chinese）
[18]?? 張? 彤， 王亞杰， 郭文雅， 李瑞梅， 劉? 姣， 郭建春， 胡新文， 姚? 遠， 耿夢婷. 木薯基因啟動子EBE區編輯載體的構建及驗證[J]. 熱帶作物學報， 2021， 42（11）： 3120-3125.
ZHANG T， WANG Y J， GUO W Y， LI R M， LIU J， GUO J C， HU X W， YAO Y， GENG M T. Construction and verification of editing vector for EBE region of gene promoter in cassava[J]. Chinese Journal of Tropical Crops， 2021， 42（11）： 3120-3125. （in Chinese）
[19]?? KAUR H，?MANNA M， THAKUR T， GAUTAM V， SALVI P. Imperative role of sugar signaling and transport during drought stress responses in plants[J]. Physiologia Plantarum， 2021， 171（4）： 833-848.
[20]?? KOMAITIS F， KALLIAMPAKOU K， BOTOU M， NIKOLAIDIS M， KALLONIATI C， SKLIROS D， DU B， RENNENBERG H， AMOUTZIAS G D， FRILLINGOS S， FLEMETAKIS E. Molecular and physiological characterization of the monosaccharide transporters gene family in [J]. Journal of Experimental Botany， 2020， 71（10）： 3110-3125.
[21]?? 董元花. 蘋果單糖轉運蛋白MdSTP1參與植物生長與非生物脅迫響應的研究[D]. 泰安： 山東農業大學， 2020.
DONG Y H. Study on apple sugar transporter MDSTP1 in mediating plant growth and stress response[D]. Taian： Shandong Agricultural University， 2020. （in Chinese）
[22]?? FLüTSCH S， NIGRO A， CONCI F， FAJKUS J， THALM-A-NN M， TRTíLEK M， PANZAROVá K， SANTELIA D. Glucose uptake to guard cells via STP transporters provides carbon sources for stomatal opening and plant growth[J]. EMBO Reports， 2020， 21（8）： e49719-e49721.
[23]?? LEMONNIER P， GAILLARD C， VEILLET F， VERBEKE J， LEMOINE R， COUTOS-THéVENOT P， LA CAMERA S. Expression of sugar transport protein STP13 differentially affects glucose transport activity and basal resistance to [J]. Plant Molecular Biology， 2014， 85（4/5）： 473-484.
[24]?? SCHOFIELD R A， BI Y M， KANT S， ROTHSTEIN S J. Over-expression of STP13， a hexose transporter， improves plant growth and nitrogen use in seedlings[J]. Plant Cell and Environment， 2009， 32（3）： 271-285.
[25]?? ROTTMANN T， KLEBL F， SCHNEIDER S， KISCHKA D， RüSCHER D， SAUER N， STADLER R. Sugar transporter STP7 specificity for l-Arabinose and d-Xylose contrasts with the typical hexose transporters STP8 and STP12[J]. Plant Physiology， 2018， 176（3）： 2330-2350.
[26]?? KONG W， AN B， ZHANG Y， YANG J， LI S， SUN T， LI Y. Sugar transporter proteins （STPs） in gramineae crops： comparative analysis， phylogeny， evolution， and expression profiling[J]. Cells， 2019， 8（6）： 560-573.
[27]?? HUAI B， YANG Q， QIAN Y， QIAN W， KANG Z， LIU J. ABA-induced sugar transporter TaSTP6 promotes wheat susceptibility to stripe rust[J]. Plant Physiology， 2019， 181（3）： 1328-1343.
[28]?? MILNE R J， DIBLEY K E， SCHNIPPENKOETTER W， MASCHER M， LUI A C W， WANG L， LO C， ASHTON A R， RYAN P R， LAGUDAH E S. The wheat gene from the sugar transport protein 13 family confers multipathogen resistance in barley[J]. Plant Physiology， 2019， 179（4）： 1285-1297.
[29]?? CAI Y， WANG L， CHEN L， WU T， LIU L， SUN S， WU C， YAO W， JIANG B， YUAN S， HAN T， HOU W. Mutagenesis of GmFT2a and GmFT5a mediated by CRISPR/Cas9 contributes for expanding the regional adaptability of soybean[J]. Plant Biotechnology Journal， 2020， 18（1）： 298-309.
[30]?? 毛興學， 柳武革， 鄭曉鈺， 范芝蘭， 陳文豐， 潘大建， 李? 晨， 王? 豐. CRISPR/Cas9技術編輯和基因創制抗穗發芽水稻新種質[J]. 植物遺傳資源學報， 2022， 23（1）： 281-289.
MAO X X， LIU W G， ZHENG X Y， FAN Z L， CHEN W F， PAN D J， LI C， WANG F. Generating pre-harvest sprouting resistant germplasms by editing and via CRISPR/Cas9 technology[J]. Journal of Plant Genetic Resources， 2022， 23（1）： 281-289. （in Chinese）
[31]?? 李兆偉， 孫聰穎， 零東蘭， 曾慧玲， 張曉妹， 范? 凱， 林文雄. 基于CRISPR/Cas9技術的osarf7突變體創建及其農藝性狀調查[J/OL]. 中國水稻科學： 1-17. http：//kns. cnki.net/kcms/detail/33.1146.S.20210708.1347.010.
LI Z W， SUN C Y， LING D L， ZEN H L， ZHANG X M， FAN K， LIN W X. Construction of osarf7 mutants in rice based on CRISPR/Cas9 technology and investigation on the corresponding agronomic traits[J/OL]. Chinese Journal of Rice Science： 1-17. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/33.1146. S. 20210708.1347.010. （in Chinese）
