橡膠樹HbREF3基因的克隆及功能初步分析

錄億隆 劉星 張宇豪 劉開業 唐朝榮

摘? 要：橡膠延伸因子（REFs）是橡膠粒子上的一種主要膜蛋白，在橡膠生物合成途徑中具有延伸橡膠烴和穩定橡膠粒子等重要作用。對橡膠樹不同組織的轉錄組測序發現，在膠乳中具有特異性的高表達，且其在HbREFs基因家族中表達水平也相對較高，僅次于表達豐度最高的。的開放閱讀框為528 bp，編碼175個氨基酸，對應的蛋白相對分子質量為19.62 kDa，理論等電點（pI）為5.28。系統進化樹分析表明，HbREF3與橡膠樹其他HbREFs雖均屬于分組Ⅰ，但與HbREF1明顯屬于不同分支。HbREFs均含有REF保守結構域，但在保守motif的分布上，不同HbREFs蛋白含有保守motif數量不等，HbREF3比HbREF1多了一個motif。生信預測分析表明，該蛋白屬于親水性蛋白，無跨膜結構域，具有14個磷酸化位點。亞細胞定位分析發現HbREF3蛋白定位在內質網上，推測其可能參與橡膠粒子的形成和膠乳的再生。本研究結果為進一步闡明基因在橡膠樹膠乳再生中的作用機制奠定了基礎。

關鍵詞：橡膠樹;橡膠延伸因子HbREF3;生物信息學分析;亞細胞定位中圖分類號：S794.1 ?????文獻標識碼：A

Cloning and Primary Functional Analysis of Gene from

LU Yilong， LIU Xing， ZHANG Yuhao， LIU Kaiye， TANG Chaorong

College of Tropical Crops， Hainan University / Natural Rubber Cooperative Innovation Center of Hainan Province & Minstry of Education of PRC， Haikou， Hainan 570228， China

Natural rubber （NR） is an important strategic material related to national economy， livelihood and national security. It is of great significance to increase the production of natural rubber by focusing on the biosynthesis process of natural rubber. Rubber elongation factors （REFs） are mainly membrane proteins on rubber particles， which play an important role in extending rubber hydrocarbon and stable rubber particles during natural rubber biosynthesis process. It is an important approach for high-yield molecular marker-assisted selection breeding of rubber trees by identifying the key REFs gene that affects natural rubber yield. We found was highly and specifically expressed in latex， and its expression level was just less than that of which is the highest expression in latex in HbREFs gene family. The open reading frame of was 528 bp， encoding 175 amino acids. The molecular weight and theoretical isoelectric point of HbREF3 was 19.62 kDa and 5.28， respectively. Phylogenetic tree analysis showed that HbREF3 and HbREF1 belonged to different branches. All HbREFs proteins contain REF domain， and HbREF3 had one more motif than HbREF1. In silico studies showed that HbREF3 protein was a hydrophilic protein， without transmembrane domain， had 14 phosphorylation sites. The results indicated that HbREF3 may not be attached to the surface of rubber particles in a mosaic form， but directly or indirectly interacted with other proteins which embedded in the lipid monolayer membrane to form a complex attached on the surface of the rubber particles. The predicted localization result is different with HbREF1 which is embedded in the rubber particle monolayer membrane. The surface of rubber particles is composed of a monolayer of phospholipid membrane， the formation and development of rubber particles may be related to lipid synthesis. Subcellular localization analysis revealed that HbREF3 was localized in endoplasmic reticulum， we speculate that HbREF3 might be directly involved in rubber particle formation and latex regeneration by participating in lipid synthesis. Moreover， overexpression of REF/SRPPs family genes in nonrubber-producing plants （Arabidopsis and Capsicum） can significantly improve the drought resistance and accumulate a large number of lipid droplets. Therefore， we speculate that HbREF3 have a similar function to REF/SRPPs family proteins of nonrubber-producing plants in responding to drought in nature rubber harvesting process. We clarified the HbREF3 expression pattern and protein characteristics which would build a foundation for elucidating the molecular mechanism of in latex regeneration in rubber trees.

; rubber elongation factor HbREF3; bioinformatics analysis; subcellular localization

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.03.007

天然橡膠（NR）因其具有較強的彈性、可塑性和良好的絕緣性，有效的散熱性和低溫下的延展性等獨特性能，除了用于生產人們日常生活不可或缺的日用、醫用等輕工業橡膠產品之外，主要作為戰略物質用于生產軍工和航空航天等國防器械，所以其經濟價值高，應用前景廣泛。近些年，雖然已有人工合成橡膠制品流向市場，但其性能不及天然橡膠，用途范圍有限，所以天然橡膠的重要地位仍未被取代，尤其是在高精尖領域所用的橡膠制品仍以天然橡膠為原料，而且隨著經濟和科技的發展，人類在高精尖領域對天然橡膠的利用大大提高，需求量也不斷增加。因此，研究天然橡膠的生物合成、提高天然橡膠產量具有重要意義。

橡膠樹是大戟科橡膠樹屬植物，其膠乳的品質好、產膠量高，是全球天然橡膠的主要來源。橡膠樹的膠乳來源于特化的乳管細胞，乳管細胞中有種特殊的細胞器負責膠乳主要成分橡膠烴的生物合成。這種特殊的細胞器被稱為橡膠粒子，其形態主要呈球形和梨形，直徑大小不一，據推測大橡膠粒子是由小橡膠粒子發育而來。橡膠粒子表面是附有多種膜蛋白的磷脂單層膜，它包裹著疏水性的聚異戊二烯，這些膜蛋白協同作用負責催化和調控天然橡膠分子鏈的合成與延伸。橡膠延伸因子（HbREFs）和小橡膠粒子蛋白（HbSRPPs）是橡膠樹膠乳中豐度最高的蛋白，同屬REF/SRPPs蛋白家族，它們與順式異戊烯基轉移酶（HbCPTs）和CPT結合蛋白（一種人Nogo B受體類似蛋白、也稱HbCPTL）形成復合體定位在橡膠粒子上，是橡膠粒子膜蛋白的主要成分。

巴西橡膠樹基因組顯示，橡膠樹中分別存在8個HbREFs和10個HbSRPPs。在非產膠植物中也有含REF結構域的蛋白，被稱為REF/RPPs樣蛋白，這些REF/SRPPs樣蛋白是同源蛋白，均屬于一個更大的植物脅迫相關蛋白家族。在橡膠樹膠乳中，橡膠延伸因子占橡膠粒子膜蛋白的10%～60%，占膠乳總蛋白的6%～10%，在橡膠生物合成途徑中具有十分重要的作用。在橡膠樹膠乳中特異超高表達，是在膠乳中表達量最高的HbREFs家族基因，發現它的蛋白序列類似于羧基端被截斷的HbSRPP1，推測其可能是由表達量較低的基因逐步進化而來。

本研究基于已發表的橡膠樹基因組數據和轉錄組數據，克隆了在橡膠樹膠乳中特異高表達的新的橡膠延伸因子基因（GeneID：110644926，與孫麗娜等報道的非同一個基因）。利用橡膠樹、橡膠草、萵苣和擬南芥中REF/SRPPs的蛋白質序列構建了系統發育進化樹，分析發現HbREF3可能是橡膠樹物種中特異的一類橡膠粒子蛋白。并對其進行了蛋白質分子量、理論等電點、親/疏水性、可能的磷酸化位點、跨膜結構域以及保守結構域等生物信息學分析。為進一步研究HbREF3蛋白在橡膠樹中的作用，本課題組還預測了HbREF3蛋白的結構，并采用煙草瞬時表達系統分析其在細胞中的定位。本研究為深入闡明基因在橡膠烴生物合成中的作用機制提供了基礎。

?材料與方法

材料

1.1.1 ?植物材料 ?煙草使用的是本氏煙（種子為本實驗室留存），在人工氣候室（溫度25℃、空氣濕度60%，光照16 h/黑暗8 h）種植，選取生長約25 d的煙草葉片進行試驗。

1.1.2? 質粒及菌株? pCAMBIA1300-35S-EGFP購自淼靈質粒平臺（http：//www.miaolingbio.com/），內質網（ER）定位Marker和細胞核定位Marker的表達質粒為本實驗室構建保存，pEASY-Blunt Zero克隆載體、大腸桿菌DH5α、根癌農桿菌GV3101購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.3? 試劑? 植物總RNA提取試劑盒（離心柱型Cat.RP55012）購自北京百泰克生物技術有限公司，逆轉錄試劑盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis kit（Cat.K1612）和限制性內切酶購自Thermo Fisher Scientific（中國），高保真DNA聚合酶試劑盒Prime STAR HS DNA Polymerase（Cat.R040A）購自TaKaRa公司，通用型DNA純化回收試劑盒（Cat.DP204）購自天根生化科技（北京）有限公司，質粒提取試劑盒（Cat. C201-01）、同源重組試劑盒ClonExpress II One Step Cloning Kit（Cat.C112-01）購自諾維贊（南京）生物技術有限公司。

方法

1.2.1? 橡膠樹膠乳總RNA的提取和cDNA合成? 膠乳總RNA的提取參照TANG等的方法，提取的總RNA使用InfiniteM200 Pro多功能酶標儀檢測其濃度及質量，并使用2%的瓊脂糖凝膠電泳對RNA的質量進一步確認。取1 μg RNA用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis kit逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，逆轉錄得到的cDNA置于–80℃備用。

1.2.2? 基因的克隆及載體構建? 利用本實驗室發表的橡膠樹基因組數據及注釋文件查找基因的完整序列，運用Premier 5.0軟件設計基因擴增引物HbREF3-F/HbREF3-R（表1）。PCR反應程序：95℃預變性5 min;95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸50 s，32次循環后，72℃再延伸10 min，16℃待機。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將含有目的基因的條帶用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化。將回收產物與pEASY-Blunt Zero克隆載體連接，轉化DH5α感受態細胞后進行Sanger測序。使用限制性內切酶 Ⅰ和H Ⅰ對pCAMBIA1300-GFP載體進行雙酶切，設計引物GFP-HbREF3-F/GFP-HbREF3-R（表1），擴增基因，通過同源重組構建pCAMBIA1300-載體。

1.2.3 ?生物信息學分析 ?使用在線網站（https：// ww.novopro.cn/tools/translate.html）將基因序列翻譯為蛋白質序列，使用Prot Param （https：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件預測HbREF3蛋白的理化性質。使用Prot Scale （https：// web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）在線軟件預測該蛋白親/疏水性。使用TMHMM Server 2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線軟件預測該蛋白是否有跨膜結構域。使用NetPhos（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Net）在線軟件分析HbREF3蛋白中可能的磷酸化位點。使用SOPMA （https：//npsa-prabi.ibcp.fr）和SWISS- MODEL （http：//www.swissmodel.expasy.org）在線軟件預測HbREF3蛋白的二級和三級結構。使用Pfam （https：//pfam.xfam.org/）和MEME （https：// meme-suite.org/meme/）在線軟件對HbREF3蛋白的結構域和保守序列進行分析。橡膠樹、橡膠草、萵苣和擬南芥中REF/SRPPs家族氨基酸序列均參照已發表文章中提供的序列號從NCBI數據庫下載，使用MEGA 7.0.26軟件構建系統發育進化樹。

1.2.4? HbREF3蛋白的亞細胞定位分析? 將測序驗證無誤的表達載體pCAMBIA1300-利用化學轉化法轉化農桿菌GV3101，挑取的陽性單克隆用帶篩選抗性的LB培養基搖至=0.4，然后在室溫下5000 g離心10 min，收集菌棄上清，用SPARKES等的方法配置的侵染液重懸2次，調至=0.4，加入乙酰丁香酮至終濃度為100 μmol/L繼續16℃、80 r/min避光搖2?h。用1?mL一次性無菌注射器注射生長約25?d的煙草葉片，避光處理30 h后，使用共聚焦顯微鏡觀察熒光信號。

2  結果與分析

2.1? 在橡膠樹中的表達分析

利用實驗室現有的橡膠樹RNAseq數據，對在橡膠樹中的表達進行可視化分析。數據表明，在HbREFs家族中除了基因之外，在橡膠樹膠乳中的表達水平也比較高（圖1A）;而且在橡膠樹不同組織中，在橡膠樹膠乳中特異性表達（圖1B）。

因此，本課題組對其在橡膠樹膠乳中特異高表達的，且表達水平僅次于的進行進一步研究。

橡膠樹基因的克隆與鑒定

本研究以橡膠樹膠乳cDNA為模板，用引物HbREF3F/HbREF3R進行PCR擴增，得到約500 bp的片段（圖2A）。通過Sanger測序分析發現擴增產物與基因組注釋的基因開放閱讀框序列完全一致，其全長528 bp，編碼175個氨基酸（圖2B）。

序列進化分析及蛋白保守結構域鑒定

為了研究與其他REF/SRPPs家族基因的親緣關系，根據已發表的橡膠樹、橡膠草基因組文章，分別收集了18個橡膠樹REF/SRPPs家族基因和10個橡膠草REF/SRPPs家族基因。此外，根據CHAKRABARTY報道的萵苣REF/SRPPs基因家族和KIM等報道的擬南芥REF/SRPPs基因家族，分別收集了8個萵苣REF/SRPPs家族基因和3個擬南芥REF/SRPPs家族基因。利用MEGA軟件對上述39個REF/SRPPs家族基因的蛋白質序列構建了系統發育進化樹。結果表明：HbREF3與橡膠樹其他HbREFs家族蛋白都屬于分組Ⅰ（Clade I），屬于橡膠樹特異的一類REFs基因，而橡膠草的TkSRPPs家族蛋白和大多數萵苣的LsSRPPs家族蛋白屬于分組Ⅱ（Clade II），其余的分布在分組Ⅲ中（Clade III）（圖3）。與在膠乳中特異高表達的雖然都屬于分組Ⅰ，但明顯屬于不同分支（圖3）。對橡膠樹HbREFs基因家族氨基酸序列進行結構域和保守序列預測，發現它們均含有典型的REF結構域（圖4A），但在保守motif的分布上，不同HbREFs蛋白含有保守motif數量不等（圖4B）。因此推測不同基因之間可能存在功能上的分化。HbREF3有5個不同的motif片段，比HbREF1多一種motif片段（圖4B），預示其功能與HbREF1可能有差異。

蛋白理化性質和生物信息學分析

對HbREF3蛋白序列及其理化性質進行預測分析發現，該蛋白相對分子質量為19.62 kDa，理論等電點（pI）為5.28，氨基酸組成中含量最高的是谷氨酸，占12.6%，不含半胱氨酸和色氨酸。對該蛋白的親/疏水性和跨膜結構域的預測分析發現，HbREF3蛋白親水區域分布明顯多于疏水區域，屬于親水性蛋白（圖5A），無跨膜結構域（圖5B），推測該蛋白可能僅位于膜的外表面。磷酸化水平預測分析發現，該蛋白有14個磷酸化位點，分別是6個絲氨酸磷酸化位點、4個蘇氨酸磷酸化位點和4個酪氨酸磷酸化位點，其中第99位氨基酸位點發生磷酸化修飾的可能性最高（圖5C）。

HbREF3蛋白質二級結構預測分析發現，該蛋白的二級結構中α-螺旋占68%，無規則卷曲占25.14%，延伸鏈占6.86%（圖5D）。通過SWISS-MOLD數據庫進一步對HbREF3蛋白的三級結構進行預測，發現其與二級結構的預測結果一致（圖5E）。

蛋白定位在內質網上

為進一步了解HbREF3蛋白在橡膠樹中的功能，本課題組構建了pCAMBIA1300-H融合表達載體，采用農桿菌注射煙草葉片的瞬時表達方法，對HbREF3蛋白進行亞細胞定位（圖6）。以35S：：GFP作為對照，將HbREF3分別與內質網定位Marker和細胞核定位Marker共同轉染，研究結果表明HbREF3蛋白定位于內質網上，且不定位于細胞核中。因此本課題組推測，HbREF3可能在橡膠粒子的形成和橡膠樹膠乳的再生過程中起重要作用。

討論

橡膠粒子作為聚合和貯存橡膠烴的特殊細胞器，對橡膠產量和膠乳的質量有很大影響;而橡膠延伸因子HbREFs是橡膠粒子中最豐富的蛋白質，在橡膠（順式-1，4-聚異戊二烯）聚合延伸中起重要作用。前人研究表明基因在橡膠樹膠乳中特異高表達，割膠和乙烯利處理均可以誘導其在膠乳中的上調表達，且基因在膠乳中的表達水平與膠乳產量呈正相關。本研究中的也是一個在橡膠樹膠乳中特異性高表達的HbREFs家族基因，在橡膠樹膠乳中的表達水平僅次于。編碼175個氨基酸，預測該蛋白的相對分子質量為19.62?kDa、理論pI為5.28。系統發育進化樹分析表明HbREF3雖然與基因表達水平在膠乳中特異最高表達的HbREF1屬于一個大的分組，但它們在組Ⅰ中明顯不屬于一個分支，并且在motif片段分布上，橡膠樹HbREFs家族中HbREF3有5個不同的motif片段，比HbREF1多一種motif片段，這也許會讓它在蛋白質功能上與HbREF1有些許差異。因此，對HbREF3的研究或許會對分析HbREFs在產膠生物合成中的功能提供新的見解。

前人研究表明，天然橡膠被脂質單層膜包裹形成橡膠粒子，內部是疏水區，外部親水區，而HbREFs與HbSRPPs、HbCPTLs和HbCPTs形成復合物附著在橡膠粒子表面的脂質單層膜上。在以往的HbREFs相關研究中，研究對象主要是HbREF1。本研究中，生信分析的預測結果顯示HbREF3蛋白屬于親水性蛋白，無跨膜結構域，這說明HbREF3蛋白可能不是以鑲嵌的形式附著在橡膠粒子表面，而是與鑲嵌在膜上的其他蛋白直接或間接互作形成復合體附著在橡膠粒子表面的脂質單層膜上，這同HbREF1鑲嵌在橡膠粒子膜中的報道明顯不同。

橡膠粒子的形成和發育與天然橡膠的生物合成密切相關。研究發現，橡膠粒子表面是一層磷脂單層膜，橡膠粒子的形成和發育可能與脂質合成有關。YOKOTA等在釀酒酵母中過表達REF/SRPPs（、和）基因，發現這些蛋白質定位于內質網和脂滴中，它們的表達誘導了酵母中甾醇酯和三酰甘油的積累，并影響了脂滴的形態，表明REF/SRPPs影響脂質代謝。REF/SRPPs樣蛋白在其他非產膠植物中也稱脅迫相關蛋白，過表達的擬南芥植物表現出更旺盛的營養和生殖生長并顯著增加了對干旱脅迫的耐受性。此外，發現萌發后的幼苗中有大量脂滴的積累。在擬南芥中過表達辣椒中的REF/SRPPs家族基因，促進轉基因植株的根和莖生長以及抽薹提前，并且過表達也能增強擬南芥對干旱脅迫的耐受性。以上結果表明，REF/SRPPs蛋白可能在脂質的合成、組織的生長發育和響應干旱脅迫等方面發揮重要作用。本研究利用煙草葉片瞬時表達系統對HbREF3蛋白進行亞細胞定位發現，其定位在內質網膜上，推測HbREF3可能參與了脂質的合成，進而影響了橡膠粒子的形成和膠乳再生，并且該蛋白可能有類似于擬南芥中REF/SRPPs家族蛋白響應干旱脅迫的功能，在橡膠樹中響應割膠脅迫，促進膠乳的再生。

綜上，本研究對橡膠樹基因進行克隆、生物信息學分析以及亞細胞定位，為進一步探究HbREF3蛋白在橡膠樹中的功能奠定了基礎。

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