澳洲堅果不同外植體愈傷組織誘導與不定芽增殖研究

羅一然 沈德周 縱丹 尹加筆 何承忠

摘? 要：以澳洲堅果品種‘H2’的幼嫩莖段和種子為材料，獲取腋芽、子葉和上胚軸等外植體，開展愈傷組織誘導及不定芽增殖研究，再通過石蠟切片法對不同愈傷組織的細胞結構進行觀察，分析比較不同外植體誘導的愈傷組織性質與不定芽分化效果。結果表明：適合腋芽愈傷誘導和分化的培養基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT，腋芽愈傷量大，不定芽增殖系數為3.49;適合子葉愈傷誘導的培養基為MS+2.0 mg/L TDZ+200 mg/L CH，愈傷組織多為綠色且質地緊密，誘導率高達82.2%，褐化率低至8.9%;適合子葉愈傷組織分化不定芽的培養基為MS+1.0 mg/L KT+0.2 mg/L NAA+ 1.0?mg/L GA，不定芽長勢較好，增殖系數為5.40;上胚軸幾乎不產生愈傷組織，可直接分化不定芽;適合上胚軸分化不定芽的培養基為MS+1.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA，增殖系數為7.37。細胞學觀察發現，腋芽愈傷組織的細胞體積較大、液泡化程度較高、細胞質較少、細胞核較小，且細胞間排列分散且不規則，顯示出非胚性愈傷組織特征;子葉愈傷細胞排列較緊密、細胞核較大、細胞質較厚且被染色深，顯示出分生組織細胞的特征。比較而言，子葉是誘導愈傷組織的優良材料，上胚軸是不定芽增殖的最佳外植體。

關鍵詞：澳洲堅果;外植體;愈傷組織;不定芽;增殖中圖分類號：S664.9 ?????文獻標識碼：A

Callus Induction and Adventitious Bud Proliferation in Different Explants of

LUO Yiran， SHEN Dezhou， ZONG Dan， YIN Jiabi， HE Chengzhong

1. Key Laboratory for Forest Genetic and Tree Improvement & Propagation in Universities of Yunnan Province， Southwest Forestry University， Kunming， Yunnan 650233， China; 2. Dali Vocational and Technical College of Agriculture and Forestry， Dali， Yunnan 671003， China; 3. Dehong Forestry and Grassland Bureau， Dehong， Yunnan 678400， China

The axillary buds， cotyledons and epicotyls which were obtained from young stem segments and seeds of ‘H2’ were used as the explants， the callus induction and adventitious bud proliferation， and then cytological observations of the different callus by paraffin slice were conducted to analyze and compare the callus properties and adventitious bud differentiation effects induced by different explants. The suitable medium for axillary buds was MS+2.0?mg/L 6-BA+0.5?mg/L KT， which had the large numbers of callus and the adventitious bud regeneration coefficient was 3.49. The suitable medium for cotyledon callus induction was MS+2.0 mg/L TDZ+ 200?mg/L CH， the callus in this medium were green and tight， the induction rate was 82.2%， the browning rate was 8.9%， the cooperation of CH and TDZ not only helpt to improve the induction rate of cotyledon callus， but also reduced the browning rate. The optimal medium for adventitious buds of cotyledon callus differentiation was MS+1.0?mg/L KT+0.2?mg/L NAA+1.0 mg/L GA， the adventitious buds grew well and the regeneration coefficient was 5.40. The suitable medium for epicotyls adventitious bud differentiation was MS+1.0 mg/L KT+0.5?mg/L NAA， and the regeneration coefficient was 7.37. The adventitious bud differentiation ability of the three explants from high to low was epicotyl>cotyledon>axillary bud， and KT combined with other suitable concentrations of growth regulators could produce better adventitious bud differentiation effect， which is the key to promote adventitious bud differentiation. The cotyledons and axillary buds dedifferentiated into callus， and then redifferentiated into adventitious buds， but the epicotyls could directly differentiate adventitious buds without producing callus. The callus induced by axillary bud and cotyledon showed obvious differences in appearance and cytology. A relevant cytological observation showed that the axillary bud callus had large cell volume， high degree of vacuolation， little cytoplasm， and small nucleus， with scattered and irregular intercellular distribution， showing the characteristics of non-embryonic callus， while the cotyledon callus had compact cell arrangement， large nucleus， and deeply stained thick cytoplasm， showing the characteristics of meristematic cell. In comparison， cotyledon is an good material for callus induction， and epicotyl is the best explants for adventitious bud proliferation， the cotyledon callus have some characteristics of embryogenic callus and high differentiation capability， it can be used as a test material for genetic transformation and polyploid induction of macadamia.

; explants; callus; adventitious bud; proliferation

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.03.012

澳洲堅果（ F. Mull）又叫澳洲胡桃、夏威夷果、昆士蘭堅果，是一種原產于澳大利亞的常綠喬木果樹。澳洲堅果的果仁油分含量高達70%～80%，且含有大量不飽和脂肪酸，被認為是世界上最美味的干果之一，在國際市場上供不應求，擁有非常良好的市場前景。近年來，澳洲堅果在云南省的發展備受重視，已成為繼核桃之后深受群眾歡迎的特色經濟林樹種。截至2020年底，云南全省種植面積已超266?000 hm，成為中國乃至全球最大的澳洲堅果種植基地。

澳洲堅果苗木繁育主要采用嫁接繁殖，但嫁接法費時費工，且易受母株繁殖材料數量與質量以及不良氣候環境的限制，難以實現良種苗木規模化生產。植物組織培養育苗技術既能保持母株優良特性，又可以擺脫氣候環境變化的不利影響，便于良種繁殖生長和周年生產，已成為一些園藝作物工廠化育苗的主要方式。關于澳洲堅果組織培養的研究已有不少報道，MULWA和BHALLA等探討了不同濃度的BA和GA對澳洲堅果組培苗增殖和長勢的影響，并進一步優化了組培體系。GITONGA等研究了不同基本培養條件下，澳洲堅果組培苗的生長情況，發現在WPM培養基上幼嫩莖段的萌芽率最高，但生根培養沒有成功。CHAUM等選用蛭石代替MS培養基中的瓊脂，并補充高濃度CO，使澳洲堅果組培苗誘導出了發達的根系。郭凌飛等以澳洲堅果莖段為外植體進行試驗，獲得了萌芽率較高的培養基配方，但未能成功獲得生根苗。肖再云通過莖段培養的愈傷組織和畸胚分化出不定芽，利用單芽誘根60 d后再于沙床中煉苗60 d，最終獲得生根苗。荷蘭秀選用適當的紅外照射和LED光源照射，提高了澳洲堅果外植體的萌芽率。然而，目前澳洲堅果組培技術尚不成熟，存在外植體取材單一、培養周期長和增殖系數低等問題，限制了澳洲堅果良種快繁工作的開展。

愈傷組織是不定芽增殖、多倍體誘導、細胞培養和遺傳轉化等研究的常用材料。為了建立高效的增殖體系，獲得可供遺傳轉化研究的愈傷組織，需要比較不同類型外植體的培養效果。一般而言，莖段和葉片因取材、預處理、滅菌及培養等環節操作簡易而成為普遍采用的外植體。對于許多木本植物，培養胚、胚乳、子葉、胚軸是誘導胚性愈傷組織的有效材料，可以建立穩定性好、誘導系數高的快繁體系，但在澳洲堅果上尚無相關報道。因此，建立澳洲堅果愈傷誘導和再生技術，對其苗木快繁、種質保存利用、遺傳改良等方面有重要意義。本研究擬以澳洲堅果的腋芽、子葉及上胚軸為外植體，通過篩選不同的生長調節劑配比和培養條件，比較研究不同外植體愈傷組織誘導及分化能力的差異，明確適宜誘導愈傷組織及分化不定芽的培養條件，為澳洲堅果組培育苗技術研究提供參考，并為澳洲堅果基因工程研究奠定基礎。

材料與方法

材料

從德宏州林業和草原局苗圃中心引進由澳洲堅果品種‘H2’的種子繁殖而來的2年生實生苗，并將該實生苗栽種于西南林業大學（云南昆明）的溫室大棚內，待其生長正常后，于3—7月間采集其剛抽梢長4～5 cm的幼嫩帶芽莖段為外植體。種子材料取自苗圃中心處于盛果期（6—7月）的‘H2’實生樹，采集其未脫落、飽滿且無病蟲害的果實，去除果皮后保存在4℃冰箱中備用。

?方法

1.2.1? 澳洲堅果莖段培養? 將采集的幼嫩莖段剪去葉片，仔細清洗后將其置于燒杯中進行流水沖洗1 h，再經75%乙醇浸泡20 s、無菌水沖洗4次、5%次氯酸鈉浸泡3 min、0.1%升汞處理5 min、無菌水沖洗4～6次后，在超凈工作臺上截取2 cm左右的莖段，接種至WPM+ 2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA+200 mg/L AC的培養基上，培養15 d，獲得健壯的腋芽。

1.2.2 ?澳洲堅果種子滅菌以及子葉、上胚軸獲取 ?將種子放入滅菌蒸餾水中浸泡24?h，取出并用濾紙吸干種子表面的水分，再置于75%乙醇中浸泡10?s后，在超凈工作臺上利用堅果鉗打開種殼，取出種仁且放入0.1%升汞中滅菌2?min，用手術刀將種仁平均切成2部分，即含胚芽部分和純子葉部分（圖1A）。上胚軸獲取（圖1B）：將含胚芽部分的種仁接種在MS空白培養基上，待萌發后獲得上胚軸。子葉獲取：用手術刀將含純子葉部分的種仁切成長×寬×高=3 mm×4 mm×2 mm的方塊。

1.2.3? 愈傷組織誘導與不定芽分化? （1）腋芽愈傷組織誘導與不定芽分化。待莖段外植體的腋芽長至1～2 cm時，將其切下插入分化培養基中，誘導愈傷組織和不定芽。培養條件如表1所示，以MS為基本培養基，添加不同濃度的噻苯隆（TDZ）、6-芐基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）和激動素（KT）。每個處理接5瓶，每瓶接入3個單芽，重復3次。于45 d后統計不定芽增殖系數（不定芽增殖系數=不定芽個數/接種的腋芽數）。

（2）子葉愈傷組織誘導。將含子葉部分的種仁接入愈傷誘導培養基，暗培養15 d后轉入光照環境，記錄愈傷誘導情況，并注意移除褐化材料。培養條件如表2所示，以MS為基本培養基，分別添加不同濃度的TDZ、6-BA和水解酪蛋白（CH）。每個處理接種5瓶，每瓶接入3片子葉，重復3次。于45 d后統計愈傷誘導率和褐化率。誘導率=誘導出愈傷的子葉個數/接種的子葉數×100%，褐化率=褐化的子葉個數/接種的子葉數×100%。

1.2.4 ?子葉愈傷組織誘導分化不定芽 ?將子葉愈傷組織取出，剪去褐化和壞死部分，切成1?cm× 1?cm的方塊，接入不定芽分化培養基，觀察記錄叢生芽的生長情況。培養方案：以MS為基本培養基，設計L（3）的正交實驗，因素水平為：KT（1.0、2.0、3.0 mg/L）、NAA（0.2、0.5、1.0 mg/L）、赤霉素（GA3，0.2、0.5、1.0 mg/L）。每個處理接5瓶，每瓶接入3個愈傷組織，重復3次，于30 d后統計不定芽分化系數（不定芽分化系數=不定芽個數/接種的愈傷組織塊數）。

1.2.5 ?上胚軸愈傷組織誘導與不定芽分化? 胚芽部分在培養基上萌發后，待上胚軸伸長至4～5 cm時，將上胚軸平均剪成胚軸和頂芽兩部分，頂芽部分接種到腋芽愈傷組織誘導培養基中繼續增殖分化，胚軸部分接入分化培養基進行誘導。培養條件：以MS為基本培養基，添加不同濃度的6-BA（1.0 mg/L）、KT（1.0 mg/L）、NAA（0.5 mg/L）、GA（0.5 mg/L）和吲哚丁酸（IBA，0.5 mg/L）。每個處理接種5瓶，每瓶接種2個外植體，重復3次。于30?d統計不定芽分化系數（不定芽分化系數=不定芽個數/接種的上胚軸數）。

1.2.6 ?愈傷組織細胞學觀測方法? 將腋芽和子葉誘導得到的愈傷組織制成石蠟切片，分別對其表面結構特征進行細胞學觀察。試驗采用常規石蠟切片法，過程包括取材、滅活、固定、保存、脫水、浸蠟、包埋、切片、粘片、染色、封片，最后在顯微鏡下的對切片觀察拍照。

?數據處理

試驗相關數據經整理后，采用SPSS 17.0、Excel 2007等軟件進行統計分析，顯著性水平設置為α=0.05。

結果與分析

植物生長調節劑對腋芽愈傷組織誘導與分化的影響

經觀察發現，腋芽愈傷組織在接種15?d左右從腋芽基部的切口處開始產生，愈傷質地緊密，為乳白色海綿狀（圖2A）;再培養30?d左右，愈傷組織則分化出不定芽（圖2B）。植物生長調節劑對腋芽增殖的結果如表3所示，不同處理間的增殖系數差異較大，以處理7和處理3的增殖系數較大，分別為3.49和3.09，但二者差異不顯著;其次是處理8（2.91）、處理4（2.67）和處理1（2.56），三者之間未達到顯著差異水平，但三者均顯著低于處理7，而與處理3差異不明顯;處理5的增殖系數最低，僅為1.27。所有處理均能誘導出愈傷組織，處理1、4、7所誘導的愈傷量較多，其次是處理2、3、8，處理5最少。本研究發現，TDZ或6-BA與高濃度的NAA（1.0?mg/L）組合易造成芽的玻璃化，而二者與低濃度的NAA（0.5?mg/L）組合則使得不定芽長勢良好;在處理5～8中，KT與TDZ組合導致腋芽愈傷誘導量及不定芽增殖效果較差，而KT與6-BA組合對腋芽增殖效果較好。

?植物生長調節劑對子葉愈傷組織誘導與分化的影響

2.2.1 ?愈傷組織誘導? 將含子葉部分的果仁在培養基上暗培養15 d左右，可觀察到子葉由乳白色轉變成淡黃色（圖3B），之后轉入2000 Lx光照條件下進行培養，15 d后分化出不同形態的愈傷組織（圖3C、圖3D）。

由表4可知，處理9、11和12誘導出的愈傷組織都呈白色，且為松散狀;處理1、2、4和8誘導出的愈傷組織主要呈綠色，且質地緊密;處理3、5、6、7與10等5個處理誘導的愈傷組織大多質地松散，顏色為黃綠色。愈傷組織誘導率在不同處理間存在較大差異，其中，處理3和處理2的誘導率較高，分別為86.7%和82.2%，但二者差異不顯著;其次是處理9，誘導率為75.6%;誘導率最低的是處理10，僅為31.1%。隨著TDZ或6-BA濃度的升高，處理1～3、4～6以及7～9間的愈傷誘導率分別顯著升高，但處理10～12間的差異不顯著。相同濃度下，添加TDZ的培養基所產生的愈傷誘導率（處理1～3和7～9）要高于6-BA（處理4～6和10～12）（表2、表4）。

愈傷組織在培養過程中普遍伴隨著褐化現象。本研究發現，植物生長調節劑的選擇和其濃度水平對子葉愈傷褐化產生較大影響。由表2和表4可知，不同處理間的褐化率差異較大，以處理11的褐化率最高，達68.9%;其次是處理7～10和12等5個處理，褐化率為55.6%～66.7%，且處理間差異不顯著;處理2的褐化率最低，僅為8.9%。添加TDZ時，處理1～3的褐化率以處理2最小，顯著低于處理1和3;處理7～9的褐化率隨TDZ濃度的增加而下降，但三者間差異不明顯。添加6-BA時，處理4～6的褐化率隨濃度的增加而顯著升高，而處理10～12間的褐化率差異不明顯。同時，未添加CH的處理（處理7～12）嚴重發生褐化現象，其褐化率顯著高于添加了CH的處理（處理1～6）。

2.2.2 ?不定芽分化? 將子葉的愈傷組織接種到不定芽分化培養基，30 d后陸續分化出不定芽（圖3E、圖3F）。由表5可知，不定芽的長勢和分化系數在不同處理間差異較大。其中，處理3的不定芽伸長明顯、葉片舒展，且增殖系數最高，達到5.40;其次是處理4和5，不定芽生長正常，

葉片或舒或卷，分化系數分別為4.47與4.02，但二者差異不明顯;處理9的不定芽分化系數最低，僅為0.76，且芽弱小、玻璃化。試驗結果顯示，隨著NAA濃度升高，處理1～3間的不定芽分化系數明顯增加，且芽體生長良好，而處理4～6及處理7～9之間的不定芽分化系數明顯降低，其中處理4～6的芽體正常，處理7～9的芽體玻璃化嚴重。

不同因素水平的極差分析結果顯示（表6），KT對不定芽分化的影響最大，其分化系數極差值為2.24，而NAA對不定芽分化的影響最小，其分化系數極差值為0.34。方差分析結果顯示（表7），KT與不定芽分化系數顯著相關（<0.05），且F值最高，為5.185;而NAA和GA水平間的分化系數差異均不顯著（>0.05）。

植物生長調節劑對上胚軸誘導不定芽分化的影響

經觀察發現，上胚軸幾乎不產生愈傷組織，不定芽大多從上胚軸的基部產生;上胚軸在培養15 d后開始誘導出不定芽（圖4A），接種30 d后不定芽葉片舒展、長勢良好（圖4B）。由表8結果可知，不同處理間的不定芽分化系數差異較明顯。與對照（處理7）相比，處理1～6的不定芽分化系數均顯著升高。其中，處理4的不定芽分化系數最高，平均每個外植體可分化7.37個不定芽;其次是處理5、1及2，不定芽分化系數分別為為6.60、6.20、6.13，三者之間差異不明顯;處理3和6的不定芽分化系數幾乎相當，與處理1和2也差異不明顯，但顯著低于處理4和5。

?澳洲堅果愈傷組織細胞學觀測

觀察石蠟切片發現，腋芽愈傷組織的細胞大部分體積較大、液泡化程度較高、細胞質較少、細胞核較小，且細胞間排列分散且不規則（圖5A），顯示出分化活性低的非胚性愈傷組織特征。子葉愈傷組織主要表現為細胞排列較緊密、細胞核較大、細胞質較厚且被染色深（圖5B），顯示出分生組織細胞的特征。

討論

植物不同基因型甚至同一基因型的不同部位，其組織的再生能力也不同。許多學者在研究木本植物愈傷組織誘導及分化時，會比較同種植物不同組織部位的誘導效果來選擇合適的外植

體。本研究發現澳洲堅果不同外植體材料的愈傷組織誘導及不定芽分化有明顯差異，子葉和經莖段培養而獲得的腋芽均能分化出愈傷組織，但經胚芽培養而成的上胚軸幾乎不產生愈傷，且這3個材料的不定芽分化系數由高到低依次為上胚軸>子葉>腋芽，說明澳洲堅果上胚軸具有較強的不定芽分化能力。另外，上胚軸是直接從其基部分化出不定芽，而子葉和腋芽則是經愈傷誘導后分化形成不定芽，說明這3種材料的不定芽分化方式不同，其分化機制有待于探究。

不同外植體誘導出的愈傷組織在形態、質地和顏色等方面存在一定差異，且不定芽分化能力也有所不同。本研究發現，腋芽誘導的愈傷組織為乳白色且細胞結構疏松，子葉誘導出的愈傷組織多為綠色或黃綠色，但細胞結構較緊密，表明腋芽和子葉誘導出的愈傷組織在外觀和細胞學上都表現出明顯的差異;同時，盡管這兩種外植體的愈傷組織都能誘導產生不定芽，但子葉愈傷組織的不定芽增殖系數相對較大。究其原因，這可能與外植體材料類型有關，因為澳洲堅果果仁富含鐵、磷、鈣、維生素以及多種氨基酸，這些物質為子葉愈傷的誘導分化提供了充足的能源。雖然子葉愈傷組織已具備胚性組織的部分特征及較強的分化能力，可作為研究澳洲堅果遺傳轉化和多倍體誘導的供試材料，但其是否為胚性愈傷組織還有待于進一步確定。

研究結果表明，TDZ或6-BA與不同濃度的NAA、KT或CH組合影響了不同外植體愈傷組織的形成與分化。對于腋芽，低濃度的NAA與TDZ或6-BA組合能誘導愈傷形成且分化出長勢良好的不定芽，而KT僅與6-BA組合才能表現出較好的愈傷及分化效果，且KT濃度越低，該組合的效果越好。這暗示了低濃度NAA和KT的促進效應，也意味著KT與TDZ、6-BA之間的協同作用不同。對于子葉愈傷的誘導，TDZ較6-BA效果更好，與AINSLEY等使用TDZ誘導杏仁子葉愈傷組織的結果相似，其原因可能是子葉需要有效刺激才能促進脫分化，而TDZ誘導愈傷組織的速率高于其他植物生長調節劑數十倍。有報道指出，CH可提高愈傷誘導率，改善愈傷質量。本研究中，添加CH（200 mg/L）不但有助于提高愈傷誘導率，還能減少褐化現象的發生，可與TDZ（2.0?mg/L）協同誘導出較多的且質地較緊密的子葉愈傷組織，這與景寧等在桃兒七成熟種胚愈傷組織誘導的報道較一致。因此，以MS+ 2.0?mg/L TDZ+200?mg/L CH為培養基，可以較高效地誘導出質量較好的子葉愈傷組織。

KT能促進細胞分化、調節營養物質運輸和葉片氣孔開閉，對愈傷組織分化不定芽效果尤為明顯。黃娟等在杉木研究中發現，將杉木的胚、子葉、下胚軸和組培苗莖段所誘導的不同質地類型愈傷組織接種到含有KT的培養基中，均獲得較高的增殖率。本研究發現，腋芽愈傷誘導不定芽分化以MS+2.0?mg/L 6-BA+0.5?mg/L KT的處理效果較好，對子葉愈傷增殖效果較好的生長調節劑組合為MS+1.0?mg/L KT+0.2?mg/L NAA+1.0 mg/L GA，誘導上胚軸分化不定芽系數較高的培養基為MS+1.0?mg/L KT+0.5?mg/L NAA，說明KT與其他適宜濃度的生長調節劑配合使用均能使3種外植體產生較好的不定芽分化效果，但不同生長調節劑間的交互作用機制有待于進一步研究。值得注意的是，在所測試的不同生長調節劑因素水平中，KT與子葉愈傷增殖系數顯著相關且對不定芽分化的影響最大，表明KT在誘導子葉愈傷增殖分化方面發揮主要作用。另外，GA可以提高種子活力，調節種子內部激素平衡，對調控子葉愈傷分化也起到一定功效。

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