血清外泌體miR-4429對非小細胞肺癌的診斷價值

張 浩，張 遜，孫大強

(天津市胸科醫(yī)院 胸外科，天津300222)

肺癌是我國死亡率最高的惡性腫瘤[1]。非小細胞肺癌(NSCLC)作為常見的診斷類型，約占肺癌的85%，其發(fā)病隱匿，受目前檢測方法限制，約75%NSCLC患者診斷時已為晚期，5年生存率不足20%[2]。目前，臨床常用的肺癌血清腫瘤標志物有癌胚抗原(CEA)、糖類抗原125(CA125)、細胞角蛋白片段19(CYFRA21-1)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)等，但它們的敏感度均較低，尚難滿足肺癌的臨床診斷需求，特別是對于早期肺癌的識別[3]。因此，探尋高敏感度、高特異度的新型腫瘤標志物，以提高臨床對于肺癌的診斷水平有著重要意義。

外泌體是一種直徑約為50-200 nm的雙分子層脂質(zhì)囊泡，在血液、尿液、唾液等中均廣泛存在，其內(nèi)含核酸、蛋白質(zhì)等多種生物信息分子[4]。研究發(fā)現(xiàn)[5]，外泌體能夠反映源于細胞的生理病理狀態(tài)，故在疾病早期診斷及預后判斷中有著重要作用。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一種約有9-25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，是外泌體內(nèi)核酸的主要類型之一。近年研究表明[6]，外周血外泌體miRNAs表達水平的檢測對于惡性腫瘤的評估有重要作用。miR-4429已被證實參與了多種疾病的發(fā)病、進展過程，可調(diào)控腫瘤的增殖、侵襲、轉移等病理過程[7-8]。本研究通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)法檢測miR-4429在NSCLC患者血清外泌體中的表達水平，分析其與臨床病理特征的關系，評價其作為肺癌診斷標志物的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年6月-2021年4月本院收治的NSCLC患者174例(NSCLC組)，其中男109例，女65例，年齡45-71(58.65±7.12)歲。納入標準：(1)經(jīng)組織病理學檢查確診為NSCLC；(2)尚未接受任何抗腫瘤治療；(3)臨床病理資料完整。排除標準：(1)伴有其他惡性腫瘤；(2)有其他肺部疾病者；(3)感染或妊娠。另選取同期本院體檢中心健康體檢者160例(健康對照組)，其中男112例，女48例，年齡40-70(57.26±7.89)歲。兩組性別、年齡等比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1標本采集 抽取空腹靜脈血5 ml，置于促凝管中。血液標本于4℃環(huán)境下離心(3 500 r/min)10 min，取上清放置于無RNA酶的離心管中，標本于-80℃環(huán)境下保存。

1.2.2血清外泌體的提取與鑒定 采用ExoQuick-TM試劑盒(美國SBI公司)進行血清外泌體的提取，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。取上述待測血清標本，解凍后，吸取500 μl血樣，加入126 μl ExoQuick試劑，予以充分混勻。4℃條件下孵育30 min，然后在室溫下離心(1 500×g)30 min，除去上清液，然后加入PBS緩沖液約200 μl重懸即得外泌體懸液。參照文獻方法[9]對獲得外泌體進行鑒定。

1.2.3血清外泌體RNA的提取 應用microRcute血清/血漿miRNA提取分離試劑盒(中國Tiangen公司)進行外泌體中RNA的提取，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。將提取的總RNA放置在冰上，采用分光光度計進行總RNA濃度及純度的檢測。

1.2.4qRT-PCR檢測血清外泌體中miR-4429表達水平 按逆轉錄試劑盒說明進行反轉錄獲得互補DNA，置于-20℃環(huán)境下保存。采用熒光定量PCR儀(美國Thermo Forma公司)進行實時熒光定量PCR檢測。擴增條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，共45個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-4429的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 NSCLC患者與健康人血清外泌體miR-4429表達水平比較

NSCLC患者血清外泌體miR-4429相對表達量為(0.54±0.12)，相比健康對照人群顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 NSCLC患者與健康人血清外泌體miR-4429表達水平比較

2.2 NSCLC患者血清外泌體miR-4429表達水平與臨床病理特征的關系

分析顯示，血清外泌體miR-4429相對表達量與NSCLC患者TNM分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)，Ⅰ-Ⅱ期、無淋巴結轉移者miR-4429相對表達量分別高于Ⅲ-Ⅳ、有淋巴結轉移者；而血清外泌體miR-4429相對表達量與NSCLC患者年齡、性別、吸煙史、病理類型、腫瘤直徑、組織學類型無相關性(P>0.05)。見表2。

表2 NSCLC患者血清外泌體miR-4429表達水平與臨床病理特征的關系

2.3 血清外泌體miR-4429對NSCLC的診斷價值

ROC曲線分析顯示，血清外泌體miR-4429區(qū)分NSCLC與健康人群的曲線下面積為0.918(95%CI 0.870-0.952，P<0.001)，敏感度為83.33%(145/174)，特異度為93.75%(150/160)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，血清外泌體miR-4429還能夠較好區(qū)分早期肺癌(Ⅰ-Ⅱ期)與健康人群，其曲線下面積為0.871(95%CI 0.822-0.909，P<0.001)，敏感度為75.00%(81/108)，特異度為96.25%(154/160)。見圖1、圖2和表3。

圖1 血清外泌體miR-4429區(qū)分NSCLC與健康人群的ROC曲線

圖2 血清外泌體miR-4429區(qū)分早期NSCLC與健康人群的ROC曲線

3 討論

尋找新型的腫瘤標志物是肺癌診斷、治療及監(jiān)測肺部病變之關鍵。為探尋NSCLC的腫瘤診斷標志物，本研究對NSCLC患者血清外泌體miR-4429表達水平進行檢測分析，實驗發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者中miR-4429相對表達量相比健康對照組明顯下調(diào)，miR-4429相對表達量診斷NSCLC的ROC曲線下面積為0.918，診斷早期肺癌的曲線下面積為0.871，這提示外泌體miR-4429可能是NSCLC的潛在診斷標志物。

近年研究表明[10-11]，miRNA參與細胞增殖、分化、凋亡等多種細胞生理過程。miR-4429因在不同種類惡性腫瘤中發(fā)揮著不同的作用，受到廣泛關注。在宮頸癌中[12]，miR-4429通過靶向FOXM1，調(diào)控宮頸癌細胞的增殖、遷移、侵襲。而在結直腸癌中，miR-4429通過調(diào)控SMAD3誘導的上皮間質(zhì)轉化，抑制結直腸癌細胞的侵襲和遷移[13]。在肺癌研究中，何文舉等[14]認為，miR-4429可調(diào)控肺癌增殖、轉移，與肺癌患者預后相關。

表3 血清外泌體miR-4429對NSCLC及早期NSCLC的診斷效能分析

目前，臨床對于早期肺癌的診斷主要采取CT掃描，雖然能夠在一定程度上改善患者預后，但存在假陽性率高、費用昂貴等問題，容易出現(xiàn)過度診斷情況并帶來放射危害[15]。鑒于外泌體檢測有著“液體活檢”的優(yōu)勢，外泌體RNA的檢測對于惡性腫瘤的篩查有著巨大潛力，作為一種非侵入性、簡便、敏感的新型生物標志物，可用于協(xié)助NSCLC等惡性腫瘤的早期診斷[16]。研究表明[17-19]，外泌體來源的miR-21、miR-20b-5p、miR-205-5p、miR-152-5p表達異常，這些miRNA有望在早期肺癌診斷中得到應用。Cazzoli等[20]通過對30份血漿標本進行檢測發(fā)現(xiàn)，miR378a、miR379a及miR-139-5p在肺癌患者血清外泌體中均呈明顯高表達，聯(lián)合診斷肺癌的ROC曲線下面積為0.908。

與血清中總miRNA相比，外泌體miRNA有著更強大的抗降解能力，穩(wěn)定性更好[21]。外泌體的保護可提高miRNA的穩(wěn)定性，進而使得其作為疾病診斷標志物的潛力提升。目前，臨床診斷NSCLC，常采用CEA、CYFRA21-1、NSE等血清腫瘤標志物進行輔助評估。CEA作為一種廣譜腫瘤標志物，在肺癌診斷中的敏感度為35%-77%[22]。CYFRA21-1是肺癌較為敏感的診斷標志物，對肺癌有較好診斷效能[23]。NSE是一種糖酵解途徑中的烯醇化酶，有研究顯示[24]，其診斷NSCLC的敏感度為83.41%，特異度為73.79%。血清外泌體miRNA在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色，具有良好穩(wěn)定性，能夠反映腫瘤細胞生物學特性，可作為NSCLC輔助診斷的選擇。本研究表明，血清外泌體miR-4429在NSCLC診斷中有著較高的敏感度(83.33%)和特異度(93.75%)，更為重要的是，其能夠有效區(qū)分早期NSCLC與健康人群。

本研究存在局限性，首先，屬于單中心研究，樣本量較小，仍需大規(guī)模研究進行驗證；其次，對照組均為健康人群，未納入肺部良性病變等其他疾病進行對照，難免存在觀察對象的選擇偏倚，仍有待更嚴謹?shù)膶嶒炘O計進行后續(xù)研究，來評價血清外泌體miR-4429對NSCLC的診斷效能；再次，未將血清外泌體miR-4429與常規(guī)血清腫瘤標志物對NSCLC的診斷價值進行對比，未來有待進行相關研究，并探討miR-4429聯(lián)合常規(guī)血清腫瘤標志物是否能夠提高NSCLC的診斷效能。盡管存在上述不足，但本研究初步驗證了miR-4429在NSCLC診斷中的作用，為NSCLC的早期診斷提供了新的思路。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)，血清外泌體miR-4429在NSCLC患者中表達下調(diào)，對NSCLC有較高診斷價值。血清外泌體miR-4429有望成為早期肺癌診斷的新型標志物，但仍需進一步驗證。