應(yīng)用二硫蘇糖醇消除達(dá)雷木單抗對輸血相容性檢測干擾的探討

強(qiáng)新晨，楊華瑩，邵俊良

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院，江蘇 無錫214023)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種起源于骨髓的漿細(xì)胞惡性克隆增殖性疾病，好發(fā)于中老年人[1],發(fā)病率逐年增加，是血液系統(tǒng)較為常見惡性腫瘤。大多數(shù)患者隨著近些年來免疫調(diào)節(jié)劑和蛋白酶體抑制劑的臨床應(yīng)用后總體生存率有顯著提高，患者生存質(zhì)量得以改善，然而難治性和復(fù)發(fā)性骨髓瘤患者的治療效果不盡如人意。人CD38抗原為單鏈Ⅱ型跨膜糖蛋白，長度為45kDa，調(diào)節(jié)細(xì)胞活化、分化和增殖[2],通常在造血干細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞和樹突細(xì)胞中表達(dá)，外周血中性粒細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞不表達(dá)，骨髓瘤細(xì)胞高量表達(dá)，成為MM免疫靶向治療藥物作用的新靶點(diǎn)[3]。達(dá)雷木單抗(DARA)是一種針對CD38的人源免疫球蛋白(Ig)G1κ單克隆抗體，2015年成為首個獲得批準(zhǔn)用于高危性或復(fù)發(fā)性骨髓瘤患者治療的抗-CD38單克隆抗體，具有較好的臨床療效和安全性[4-5]，中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2020年修訂)中增加了DARA入選治療方案[6-7]，聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)劑和蛋白酶體抑制劑可進(jìn)一步提高療效[8]，臨床使用病例數(shù)量日趨增加。

由于紅細(xì)胞也表達(dá)CD38抗原分子，當(dāng)患者應(yīng)用DARA藥物治療時，與紅細(xì)胞表面低水平表達(dá)的CD38結(jié)合，引起不規(guī)則抗體篩檢、特異性抗體鑒定等輸血相容性檢測出現(xiàn)假陽性[9]，從而掩蓋有價值的同種免疫性抗體。隨著接受抗-CD38治療患者例數(shù)的增多，如何消除該抗體對輸血相容性檢測的干擾，保障患者輸血安全，成為亟待解決的難題，本文通過應(yīng)用二硫蘇糖醇(DTT)，結(jié)合文獻(xiàn)[10-11]選用低濃度DTT方法處理紅細(xì)胞，結(jié)合微柱凝膠法進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，消除其對輸血相關(guān)血清學(xué)試驗(yàn)干擾，確保DARA治療患者臨床用血安全。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

病例：女性患者，59歲，確診多發(fā)性骨髓瘤18月，2020年3月起采用硼替佐米聯(lián)合地塞米松/環(huán)磷酰胺化療5次及對癥支持治療，10月起DARA 700 mg聯(lián)合地塞米松及來那度胺進(jìn)行治療，患者入院時不規(guī)則抗體篩選為陰性，因患者貧血擬輸血支持治療，輸血前檢測發(fā)現(xiàn)不規(guī)則抗體篩選及特異性抗體鑒定試驗(yàn)均出現(xiàn)泛凝集反應(yīng)，顯示抗體無特異性，與供血者交叉配血主側(cè)有凝集。

1.2 試劑與儀器

試劑包括AB/D血型微柱檢測卡(長春博迅生物技術(shù)公司)；微柱凝膠檢測卡(IgG+C3d,美國BIO-RAD)；ABO反定型細(xì)胞(上海血液生物醫(yī)藥公司)；抗體篩選細(xì)胞(江陰立博醫(yī)藥生物技術(shù)公司)；pH7.2PBS緩沖液(飛凈生物科技公司)；pH8.0PBS緩沖液(飛凈生物科技公司)；1,4-二硫代-DL-蘇糖醇(DTT，美國Sigma)；相容性檢測質(zhì)控品(長春博迅生物技術(shù)公司)；抗K試劑(江陰立博醫(yī)藥生物技術(shù)公司)。儀器包括37℃卡式孵育器；卡式離心機(jī)。

1.3 0.02 mol/L DTT溶液的配置

稱取DTT1.0 g溶解于32 ml pH=8.0PBS緩沖液中，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠓盅b于PE管中，-20℃保存?zhèn)溆?，使用時先復(fù)溶,后用pH7.2PBS緩沖液1∶9稀釋。

1.4 輸血相容性檢測

患者AB/D血型、直接抗人球蛋白試驗(yàn)按照說明書要求操作，抗體篩選試驗(yàn)、抗體鑒定和交叉配血試驗(yàn)采用微柱凝膠卡法進(jìn)行，將抗體篩選細(xì)胞、抗體鑒定譜細(xì)胞和獻(xiàn)血員紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌3次后制成0.8%紅細(xì)胞懸液，操作步驟：在微柱凝膠卡上部反應(yīng)腔內(nèi)加入上述0.8%紅細(xì)胞懸液50 μl和0.02 mol/L DTT溶液25 μl，用移液器仔細(xì)混勻5次，將凝膠卡在37℃孵育15 min，再加入25 μl患者血漿，用移液器仔細(xì)混勻5次，37℃孵育15 min，然后放入卡式離心機(jī)離心，觀察有無凝集現(xiàn)象，有凝集試驗(yàn)為陽性。

1.5 對照試驗(yàn)

本研究中采用0.02 mol/L DTT處理紅細(xì)胞抗原方法設(shè)立對照試驗(yàn)，選擇表達(dá)M、Jka、E、K抗原的O型紅細(xì)胞作為對照細(xì)胞，DTT處理前均確認(rèn)M、Jka、E、K抗原為陽性，選用經(jīng)血型參比實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)抗M(IgM)、抗Jka、抗E的血漿以及抗K試劑血清分別與DTT處理前/后的M、Jka、E、K抗原紅細(xì)胞作為效果評估試驗(yàn)，操作步驟與前述相同。

2 結(jié)果

2.1 患者血型、直接抗人球蛋白試驗(yàn)

患者血型為O型，CcDEe,自身對照陰性，直接抗人球蛋白試驗(yàn)陰性；治療后，對ABO、Rh血型分型檢測無影響，自身對照陰性，直接抗人球蛋白試驗(yàn)陰性。

2.2 不規(guī)則抗體篩選、抗體特異性鑒定和交叉配血

DARA治療后21天后，未經(jīng)DTT處理，紅細(xì)胞不規(guī)則抗體篩選Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ細(xì)胞全凝集，凝集強(qiáng)度1+—2+，見圖1-(1)。經(jīng)DTT處理后，紅細(xì)胞不規(guī)則抗體篩選Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ細(xì)胞均為陰性，見圖1-(2)。紅細(xì)胞抗體特異性鑒定試驗(yàn)，結(jié)果顯示均凝集，凝集強(qiáng)度為1+—2+，顯示抗體無特異性，見圖1-(3)。選取2份與患者同型血液交叉配血試驗(yàn)主側(cè)為不合，凝集強(qiáng)度為3+，經(jīng)DTT處理后交叉配血主側(cè)相合，見圖2。

圖1 患者抗體篩選、抗體特異性鑒定試驗(yàn)結(jié)果

2.3 對照試驗(yàn)

抗M、抗Jka、抗E血漿和抗K血清與未經(jīng)DTT處理的M、Jka、E、K抗原紅細(xì)胞微柱凝膠卡反應(yīng)均為陽性；與經(jīng)DTT處理后M、Jka、E、K抗原細(xì)胞反應(yīng)均為陽性，結(jié)果顯示經(jīng)處理后不影響M、Jka、E、K抗原與對應(yīng)抗體的反應(yīng)性，見圖3。

3 討論

由于CD38抗原在MM患者淋巴細(xì)胞上廣泛高表達(dá)，CD38單克隆抗體-DARA能靶向結(jié)合腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)CD38分子，通過介導(dǎo)補(bǔ)體/抗體依賴的細(xì)胞毒作用、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用等多種機(jī)制殺傷靶細(xì)胞、消除表達(dá)CD38抗原的調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞和來源于髓細(xì)胞的抑制細(xì)胞達(dá)到免疫調(diào)節(jié)作用以及抑制CD38酶活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)[12]，已經(jīng)成為MM的免疫治療新手段，含DARA的聯(lián)合化療方案已經(jīng)成為臨床挽救性治療措施[13]，能改善患者預(yù)后、延長患者總生存期。

圖2 供血者 DTT處理前、后交叉配血結(jié)果

圖3 M、Jka、E、K抗原紅細(xì)胞DDT處理前、后抗體檢出結(jié)果

由于人類紅細(xì)胞表面也有少量CD38抗原表達(dá)，DARA可以和患者、供血者、抗體篩選試劑紅細(xì)胞表面結(jié)合，導(dǎo)致患者直接抗人球蛋白試驗(yàn)假陽性，干擾不規(guī)則抗體篩選，抗體特異性鑒定反應(yīng)呈全陽性反應(yīng)，與供血者交叉配血主側(cè)呈陽性反應(yīng)，造成輸血相容性檢測困難，影響輸血治療[14-15]。通常情況下，抗-CD38抗體與患者紅細(xì)胞結(jié)合后會導(dǎo)致直抗實(shí)驗(yàn)陽性，但是該種結(jié)合不會影響血型鑒定，本研究中患者紅細(xì)胞直抗試驗(yàn)應(yīng)用DARA前、后均為陰性結(jié)果，研究表明[16]是由于隨著藥物使用后(一般7天以后)抗體對紅細(xì)胞表面CD38抗原清除效應(yīng)逐漸顯現(xiàn)，直抗陽性減弱甚至為陰性結(jié)果。這種對輸血相容性檢測的干擾可在末次使用后持續(xù)2-6個月[17]，有可能掩蓋患者血漿中存在的其他同種免疫抗體，引發(fā)溶血性輸血反應(yīng)，給患者造成輸血風(fēng)險。有學(xué)者建議在患者應(yīng)用DARA前預(yù)留患者血樣用于治療后續(xù)輸血相容性檢測，但是該策略由于血樣保存時效有限和不能真實(shí)反應(yīng)患者當(dāng)前免疫狀態(tài)，易造成新產(chǎn)生的同種抗體漏檢。

DTT屬于一種還原劑，可以還原破壞抗原蛋白質(zhì)中半胱氨酸之間用于維持二級結(jié)構(gòu)的二硫鍵，紅細(xì)胞表面CD38抗原被破壞后，DARA抗體無法與之相結(jié)合，消除該抗體對輸血相容性檢測的干擾。經(jīng)典法DTT預(yù)處理供血者紅細(xì)胞方法耗時長、步驟繁瑣，洗滌過程中紅細(xì)胞易溶血，造成細(xì)胞表面部分抗原破壞[18]，采用本研究方法處理紅細(xì)胞表面CD38抗原，結(jié)合微柱凝膠卡的方法，比常規(guī)微柱凝膠卡法交叉配血耗時僅增加15 min，省略紅細(xì)胞DTT處理過程中多次洗滌，實(shí)驗(yàn)時間顯著縮短。紅細(xì)胞DTT處理前患者血漿與抗體篩選細(xì)胞、抗體特異性鑒定譜細(xì)胞表現(xiàn)為全陽反應(yīng)，凝集強(qiáng)度為1+—2+，反應(yīng)無特異性，與供血者交叉配血試驗(yàn)主側(cè)不相合，凝集強(qiáng)度為3+，泛反應(yīng)性有可能掩蓋同種免疫性抗體的反應(yīng)，存在漏檢的風(fēng)險。用低濃度0.02 mol/L DTT處理上述抗體篩選細(xì)胞、特異性鑒定譜細(xì)胞后，與患者血漿均為陰性反應(yīng)，提示患者血漿中僅存在抗-CD38抗體，未檢出其他同種免疫性抗體，與獻(xiàn)血員交叉配血實(shí)驗(yàn)主側(cè)均為相合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)過DTT處理后，有效消除DARA對輸血相容性檢測的干擾，確保接受該種藥物治療患者輸血及時性、安全性。

依據(jù)我國血型意外抗體的分布情況[19-20]，紅細(xì)胞血型意外抗體檢出以Rh、MNS、KIDD和LEWIS系統(tǒng)最為常見，為驗(yàn)證改變DTT濃度處理抗原效果和對常見同種免疫性抗體檢測能力，尤其是對IgM類抗體的影響，選擇表達(dá)M、Jka、E、K抗原O型紅細(xì)胞在DTT處理前、后分別與特異性人源抗M(IgM)、抗Jka、抗E和單克隆抗K進(jìn)行間接抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示DTT處理后M、Jka、E、K抗原均能檢出，提示本方法可以保留K抗原，與Hosokaw等[21]結(jié)果相同，M抗原反應(yīng)陽性表明對IgM抗體影響較弱，DTT與抗體血清反應(yīng)時間較經(jīng)典方法短存在一定關(guān)系[22]。我國為多民族國家，Kell血型抗原分布存在種族差異，維吾爾族、回族和漢族K抗原陽性率分別為3.16%、1.36%、0.17%[23]，在少數(shù)民族地區(qū)抗K抗體產(chǎn)生幾率比漢族地區(qū)高，經(jīng)典法DTT處理紅細(xì)胞技術(shù)存在破壞CD38以外紅細(xì)胞抗原(如Kell、YT、JMH等抗原)，導(dǎo)致相關(guān)血型抗體漏檢的局限性。通過改變DTT濃度處理紅細(xì)胞，可以在保留紅細(xì)胞表面K抗原的情況下消除DARA對輸血相容性檢測的干擾，確保K抗原陰性患者輸血安全,由于樣本數(shù)量較少，可行性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。