人肝門部膽管癌細胞QBC939中Vimentin基因的siRNA構建研究

王 磊,賈劍超,宋雙龍,戚曉輝,胡向赟,王 石

(1.內蒙古醫科大學研究生學院，內蒙古 呼和浩特010110；2.內蒙古自治區人民醫院 a.臨床醫學研究中心;b.肝膽胰脾外科，內蒙古 呼和浩特010110)

肝門部膽管癌(HCC)是最常見的膽道惡性腫瘤[1]。由于HCC解剖位置特殊導致手術難度較高且患者術后5年生存率僅為30%-40%[2]。波形蛋白(Vimentin，VIM)屬于Ⅲ型中間絲(IF)蛋白的一種類型[3]。最初觀察到VIM主要在增殖細胞和未分化細胞中表達，目前許多研究共同表明VIM在肺癌、乳腺癌、前列腺癌及胃癌的發生及發展過程中有重要的作用[4]。干擾短RNA(siRNA)的特異性及穩定性較好，目前被廣泛應用于沉默特定靶基因表達的相關實驗中[5]。本實驗擬構建可抑制Vimentin基因表達的作用于不同位點的3種siRNA，并通過脂質體法將siRNA分別瞬時轉染進入QBC939細胞，從而對抑制細胞內VIM基因的表達，為后續進一步研究VIM的生物學特性及探討對腫瘤增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響奠定了基礎。

1 材料及方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞 人肝門部膽管癌細胞QBC939(BFB公司)，已采用短串聯重復(STR) DNA檢測并成功鑒定。

1.1.2試劑 胎牛血清及DMEM培養基均為BI公司生產;PBS、DMSO及青霉素-鏈霉素雙抗購自碧云天;SiRNA序列(S1序列、S2序列及S3序列)及陰性對照序列由吉瑪基因設計及合成(表1)；VIM、GAPDH引物序列由生工生物公司設計及合成；逆轉錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒(TaKaRa)；乙醇及異丙醇(富宇試劑)。

表1 siRNA核酸序列

1.2 細胞培養

QBC939細胞株的培養使用含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養基，置于恒溫培養箱(37℃，5% CO2)中培養，當細胞融合度在85%左右時對QBC939細胞進行一次傳代，并凍存一定量的細胞備用。

1.3 轉染

將轉染3種siRNA及陰性對照序列的四組分別命名為T1組(siVIM-1)、T2組(siVIM-2)、T3組(siVIM-3)及NC組(siCtrl)。首先溶解siRNA，根據說明書6孔板中siRNA的推薦量100 pmol，siRNA優化范圍50-200 pmol，培養基最終體積為2 ml進行預實驗，摸索siRNA的最佳轉染濃度為100 pmol。配置Opti-MEM與siRNA的混合物即mix①，配置Opti-MEM與RNAi MAX的混合物即mix②，將mix②加入mix①中并室溫孵育5 min，使用移液槍以300 μl/孔分別加入至6孔板中，6 h后更換完全培養基繼續培養。

1.4 轉染后提取總RNA制備cDNA

轉染24小時后，根據實驗情況收集細胞，向裝有細胞的離心管內加Trizol裂解細胞，加入氯仿靜置5 min。離心機設置為：4℃；13 000 rmp；15 min，離心后取上清，將上清轉移至EP管中并加入異丙醇，室溫靜置10 min，離心(4℃；13 000 rmp；10 min)，取出離心管并將上清棄去后加75%乙醇，在4℃，7 500 rmp，離心5 min，棄上清，晾干，測RNA濃度。取1 000 ng RNA,配置40 μl反應體系，按照Takara反轉錄兩步法進行RT-PCR來制備cDNA。

1.5 熒光實時定量PCR檢測QBC939細胞中VIM的mRNA表達水平

實驗所需VIM、GAPDH引物序列如下：VIM引物序列正義鏈：5′-TCGTGAATACCAAGACCTGCTCAATG-3′，反義鏈：5′-AATCCTGCTCTCCTCGCCTTCC-3′，堿基數分別為26、22。GAPDH引物序列正義鏈：5′-CAGATGTGGATCAGCAAG-CAGGAG-3′，反義鏈：5′-GTCAAGAAAGGGTGT-AACGCAACTAAG-3′，堿基數分別為24、27。PCR的反應體系為：TB Green Premix Ex TaqⅡ 12.5 μl；PCR Forward Primer 1 μl；PCR Reverse Primer 1 μl；滅菌水8.5 μl；除此反應體系，還需準備DNA模板2 μl。依次加入DNA模板及上述反應體系并混勻。擴增條件：95℃，30 min；95℃，5 s，60℃，30 s，40個循環；95℃，10 min；65℃，5 min；95℃，5 min。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 細胞形態學觀察

使用Leica熒光顯微鏡系統觀察到培養皿內QBC939細胞貼壁生長，各細胞間排列緊密。轉染siRNA前后的細胞生長狀態如圖1及圖2所示。

2.2 siRNA對QBC939細胞中VIM的mRNA表達水平的影響

在使用siRNA對QBC939細胞干擾48 h后，分別提取實驗組、NC組細胞中的mRNA,結果顯示:實驗組VIM的表達水平較均NC組顯著降低；此外，實驗組中T2組的抑制效果較T1及T3組更明顯，差異有統計學意義。見圖3。

圖1 光鏡下(20×)QBC939生長狀態

圖2 光鏡下(20×)轉染siRNA 24 h后QBC939細胞生長狀態

圖3 VIM的mRNA表達量

3 討論

VIM是一種分子量大小為57 kDa蛋白,在哺乳動物中，VIM是表達最廣泛的IF之一,在人體腦、肺、腎、肝、胰腺、胃腸道等多種細胞表面表達[6]。在細胞水平上，VIM與細胞分化、黏附、遷移、侵襲及凋亡等多種生物學特性密切相關[7]，使癌細胞具有更強的侵襲及轉移能力[3]。在器官水平上，VIM敲除的細胞功能與傷口愈合能力下降、動脈及血管活動有關。在機體水平上，VIM敲除與白內障、多動、平衡和(或)協調受損、焦慮相關反應增加有關[4]。

VIM在多種上皮性腫瘤中呈現為過表達狀態[8]。VIM可作為胰腺癌、胃癌預后、結腸癌及黑色素瘤的潛在生物學標志物[9-11]。本研究前期通過對內蒙古自治區人民醫院肝膽胰脾外科收治的60例已行手術治療的HCC患者的病理切片進行免疫組化研究，結果表明：VIM在癌組織中的表達水平高于癌旁組織[12]。使用RT-PCR及Q-PCR等技術對人肝門部膽管癌QBC939細胞及正常的膽管細胞HiBepic的mRNA表達情況進行分析，結果表明：QBC939細胞內VIM表達水高于HiBepic細胞內VIM表達水平，考慮抑制QBC939中VIM基因的表達水平可能為HCC的診斷及HCC的治療帶來新的幫助。

RNA干擾(RNA Interference，RNAi)又稱基因沉默(gene silencing)，是在某些疾病中阻止基因表達的一種生物學過程[13]。siRNA是RNAi過程中的重要產物[14]，也是一種雙鏈非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)[15]。siRNA被裝載在RNA誘導沉默復合體上用于在基因翻譯以前降解和切割mRNA[16]。siRNA因具有高度的特異性及級聯放大等特點而被廣泛應用于臨床治療及基因組學相關實驗的研究。siRNA在臨床給藥中主要應用偶聯介導以保證siRNA的化學穩定性，因為未經修飾的siRNA會被腎臟過濾快速降解并從循環中清除，導致組織中的生物利用度極低[17]。siRNA以各種細胞類型中的致病基因為靶點，在不破壞內源性miRNA的情況下實現對目的基因的沉默。siRNA具有高度序列特異性及治療靶點上的廣譜性，目前已被廣泛應用于基因組學相關實驗[18]。

siRNA的臨床治療及基因組學的實驗應用中同時也受到siRNA本身固有的理化特性的嚴重阻礙，例如低電荷密度、高結構剛度和快速酶降解。且部分基因mRNA靶序列常包埋在RNA分子的二級結構及高度折疊的區域中，且siRNA無法接近并識別靶序列，因此無法切割mRNA。此外，當靶基因發生基因突變時而產生新的siRNA時，也會影響siRNA抑制靶基因的效率。因此常規的siRNA中，可發揮沉默效應的siRNA僅有60%-70%[19]。建立高效、穩定的siRNA既是將其用于基因組學相關實驗的必要前提，又是用于臨床治療的堅實基礎，本實驗在設計與合成siRNA時應注意RNA內的修飾位置與修飾的化學類型，以防止siRNA沉默效應受到干擾及脫靶效應的發生[20]。因此本實驗根據前期VIM在肝門部膽管癌細胞株QBC939中表達較高的研究基礎，設計并合成三條VIM-siRNA序列及一條陰性對照序列，分別命名為S1、S2、S3及siRNA陰性對照序列，將三條序列及陰性對照序列分別用脂質體法瞬時轉染進入QBC939細胞中，根據RT-PCR及Western-Blot實驗結果可知：3組siRNA均已經成功轉入細胞內且成功抑制QBC939細胞內VIM的表達。但是三條VIM-siRNA序列沉默效果不一，S2的沉默效果較S1及S3好，差異具有統計學意義。再次表明此類實驗僅設計合成單條VIM-siRNA可能存在一定的局限性。后續本團隊將繼續探討并研究抑制VIM對QBC939細胞株增殖、侵襲及遷移中的影響及在成瘤裸鼠體內中的作用，從體內及體外等實驗綜合研究VIM與QBC939細胞的生物學行為間關系。

致謝：本文作者感謝內蒙古自治區人民醫院臨床醫學研究中心提供的實驗平臺及臨床醫學研究中心王敏老師在相關實驗操作上的指導。