蒙藥驗(yàn)方《亞日飲湯》提取物對(duì)H37RV感染小鼠血清IL-12的影響

布仁特古斯，陸 宇，馬媛媛，照 娜，烏日古瑪拉，圖門烏力吉*

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010010;2.北京市胸科醫(yī)院 藥物實(shí)驗(yàn)室;3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 蒙醫(yī)科)

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病，其治療以化學(xué)藥物治療殺滅結(jié)核分枝桿菌為主[1]。機(jī)體在清除結(jié)核分枝桿菌過(guò)程中CD4+Th1和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫及其分泌的細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-12起重要作用[2]。研究顯示中醫(yī)藥在減輕抗結(jié)核藥物毒副作用、逆轉(zhuǎn)結(jié)核桿菌耐藥情況以及抑菌、調(diào)整感染結(jié)核分枝桿菌的免疫水平方面取得了很好的療效[3]。經(jīng)臨床對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)《亞日飲湯》具有輔助治療肺結(jié)核作用,在體內(nèi)具有一定的抗結(jié)核桿菌活性[4]，其作用機(jī)理至今不清。研究發(fā)現(xiàn)該藥體外并無(wú)抗結(jié)核桿菌作用，其代謝產(chǎn)物亦無(wú)直接抑制結(jié)核桿菌作用[5]。對(duì)于結(jié)核病體液免疫并無(wú)保護(hù)作用[6]，因此，認(rèn)為該藥可能通過(guò)提高機(jī)體細(xì)胞免疫功能來(lái)發(fā)揮治療結(jié)核病作用的。結(jié)核病的發(fā)病與多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子相關(guān)，IL-12是與結(jié)核病細(xì)胞免疫關(guān)系最密切的細(xì)胞因子之一[7]，故本研究通過(guò)氣溶膠建立H37RV感染小鼠模型，給予亞日飲湯治療后，采用ELISA法測(cè)定血清IL-12的水平，間接了解該藥對(duì)細(xì)胞免疫功能的影響，預(yù)期揭示該藥的可能作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試劑去離子水、1×PBS、2N H2SO4、吐溫-20。ELISA檢測(cè)試劑盒ELISA MAXTMDeluxe Set Mouse IL-12 kit購(gòu)于Biolegend公司。包被板ELISA MAXTMUncoted Plates購(gòu)于Biolegend公司。密封膜、1.5 ml離心管。

1.2 方法

氣溶膠感染制備小鼠急性結(jié)核病模型，BALB/C小鼠，雄性，體重18-20 g，60只，分空白組;模型組;異煙肼組;亞日飲湯高、中、低劑量組，共6組，每組10只。亞日飲湯提取物小鼠灌胃高劑量每日每只216 mg一次灌胃，中劑量組每日每只108 mg一次灌胃，低劑量組每日每只54 mg一次灌胃，陽(yáng)性藥物組(異煙肼)20 mg/kg·天，空白組和模型組給予相同體積生理鹽水(不超過(guò)1 ml)每日1次，造模后治療28天。取腹主動(dòng)脈血1 ml，室溫靜置凝血后以離心半徑 3 cm，3 000 r/min離心20 min，取上清，滅活后過(guò)濾除菌保存，采用ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中IL-12，實(shí)驗(yàn)步驟按照“ ELISA MAXTM Deluxe Set Mouse IL-12 ”檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品OD450-OD570差值的均值及濃度值見表1。以標(biāo)準(zhǔn)品OD450-OD570差值的均值為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，通過(guò)散點(diǎn)圖添加趨勢(shì)線的方法，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品OD450-OD570差值的均值及濃度值(pg/ml)

圖1 血清IL-12標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度以O(shè)D450—OD570的差值為x值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=383.9x2+337.3x-7.124，y值即為樣品濃度見圖2。模型組、亞日飲湯高、中、低劑量組的水平高于空白組、異煙肼組(P<0.05)，亞日飲湯高、中、低劑量組的水平高于模型組(P<0.05)。見表2。

圖2 血清IL-12

表2 血清IL-12濃度在空白組、模型組、異煙肼組、亞日飲湯組表達(dá)水平比較

3 討論

結(jié)核分支桿菌感染機(jī)體后是否發(fā)病取決于結(jié)核桿菌的數(shù)量、毒力和機(jī)體的免疫狀態(tài)。細(xì)胞免疫在抗結(jié)核保護(hù)性免疫中起主要作用[8]。IL-12是由p40和p35亞基(p35/p40)組成的異二聚體細(xì)胞因子，IL-12的p40亞基是巨噬細(xì)胞趨化因子，可將巨噬細(xì)胞趨化到炎癥部位或腫瘤部位而增強(qiáng)固有免疫應(yīng)答作用[9-10]。IL-12在抗結(jié)核的固有性免疫和適應(yīng)性免疫中都發(fā)揮著關(guān)鍵性的生物學(xué)功能，結(jié)核桿菌對(duì)IL-12 p40亞基起到誘導(dǎo)作用，缺乏此細(xì)胞因子的人群對(duì)結(jié)核桿菌有明顯的易感性[11]。Th1細(xì)胞是機(jī)體抗結(jié)核最重要的免疫細(xì)胞，IL-12主要通過(guò)對(duì)Th1細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)而參與抗結(jié)核的免疫反應(yīng)，Th0向Th1分化中IL-12起到了無(wú)可取代的作用[12]。IL-12 p40對(duì)于針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的保護(hù)性IFN-γ反應(yīng)是絕對(duì)必需的，感染結(jié)核桿菌時(shí)機(jī)體巨噬細(xì)胞免疫功能低下，p40的生成減少，所以導(dǎo)致IL-12分泌減少，從而影響Th1細(xì)胞的生成分化，導(dǎo)致Th1/Th2細(xì)胞的表達(dá)失衡[13]。體內(nèi)IL-12缺乏時(shí),能導(dǎo)致結(jié)核桿菌在靶器官中持續(xù)生長(zhǎng)繁殖[14]。本研究結(jié)果顯示亞日飲湯高、中、低劑量組血清IL-12的水平高于空白組、模型組、異煙肼組(P<0.05)，表明亞日飲湯具有提高小鼠血清IL-12水平的作用，異煙肼組水平低于空白組，可能與異煙肼屬于一線抗結(jié)核藥物，具有直接殺傷結(jié)核桿菌作用，并非與提高免疫功能有關(guān)，空白組水平低于模型組，因空白組未曾受到H37RV感染，故只表現(xiàn)出固有免疫狀態(tài)，模型組水平高于空白組和異煙肼組，是因模型組受到H37RV感染后，血清IL-12水平有所升高，表明小鼠原有免疫狀態(tài)，但其水平升高明顯不及亞日飲湯組。IL-12在免疫應(yīng)答早期階段誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞，自然殺傷(NK)細(xì)胞和NKT細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ[15-16]。IL-12具有刺激IFN-γ分泌作用，IFN-γ水平升高是否是通過(guò)提高IL-12水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的有待于進(jìn)一步研究。本研究另一項(xiàng)結(jié)果顯示亞日飲湯具有提高小鼠血清IFN-γ水平的作用，與上述研究結(jié)果一致，二者的關(guān)聯(lián)需進(jìn)一步研究。綜上，認(rèn)為亞日飲湯可以提高H37RV感染小鼠模型血清中的IL-12水平，可能是亞日飲湯治療結(jié)核病作用機(jī)制之一。