紫草素對慢性皮膚潰瘍大鼠間隙連接蛋白家族的蛋白表達及基因表達水平的影響

杜偉鵬，張現峰，王曉歌，馬立人

（平頂山中醫醫院，河南 平頂山 467000）

皮膚潰瘍是一種由多種原因引起的難治性皮膚病，從肉體和精神上對患者造成雙重的痛苦，其主要特征是病程遷延、長期不能愈合，一般超過2周不愈合即可認定為慢性皮膚潰瘍［1］。同時，慢性皮膚潰瘍伴隨的慢性炎癥具有致癌的風險［2］。目前我國對于慢性潰瘍大樣本人群調查尚未廣泛展開，但該病的危害已經無法忽視。隨著科學技術的發展，對該病的治療已經取得長足的進步，目前西醫主要以外用藥物、高壓氧療、生長因子、皮膚移植和負壓傷口治療等手段為主［3］，雖然治療手段眾多，但療程長、代價大，效果也不盡如人意。中醫學對于慢性皮膚潰瘍的治療經驗豐富，多種藥物在該病的治療中均顯現出價值，其中以紫草的療效最為突出。紫草素是從紫草中提取的一種萘醌類化合物，對于促進皮膚愈合具有良好的效果［4］，但其作用機制尚未明確。本研究就紫草素對慢性皮膚潰瘍大鼠間隙連接蛋白（Cx）的影響展開研究，以期為紫草素治療慢性皮膚潰瘍提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級健康SD 大鼠42 只，體質量300～320 g，8～12 周齡，雌性各半，購于上海西普爾－必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2018－0006。適應性飼養1 周后用于實驗，飼養條件：室溫22～25 ℃，相對濕度50%～70%，光暗同步各12 h，自由攝食飲水。此次研究獲得江西中洪博元生物技術有限公司實驗動物倫理委員會批準，批號：2019120601，所有實驗動物的飼養和處理均符合實驗動物管理和使用規定。

1.2 主要試劑和儀器

紫草素（HPLC ≥98%，上海脈鉑醫藥科技有限公司，貨號：MED80061－1 g）；醫用凡士林紗布（新鄉市華西衛材有限公司，批號：1936031）；重組牛堿性成纖維細胞生長因子凝膠（貝復新，珠海億勝生物制藥有限公司，批號：G41B10158）；免疫組化試劑盒（上海博湖生物科技有限公司，貨號：BH－S63629）；逆轉錄試劑盒（上海博湖生物科技有限公司，貨號：BH－S63784）；Cx26、Cx32、Cx43 二抗（美國Biovision，貨號：3331－100、3330－120、3330－115）；甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GADPH，北京百奧萊博科技有限公司，貨號：ARB11900）。

實時熒光定量PCR 儀（美國伯樂Bio－Rad，型號：CFX96）；全自動組織包埋裝置（沈陽恒松科技有限公司，型號：HS－B7126－B）；石蠟切片機（沈陽恒松科技有限公司，型號：HS－S7220－B）；熒光多功能顯微鏡（日本奧林巴斯，型號：CX43）；全波長酶標儀（山東萊恩德智能科技有限公司，型號：LD－96A）；垂直電泳轉印系統（美國伯樂Bio－Rad，型號：1658033）；微量核酸蛋白分析儀（北京創譽科技有限公司，型號：Aurora－900）。

1.3 模型構建和分組

所有大鼠在造模前4 d 注射青霉素鉀溶液（400 U/只）防止感染，每天1 次。4 d 后隨機選擇30 只大鼠采用戊巴比妥鈉麻醉，標記4 cm×4 cm 面積剃除背部毛發，8%硫化鈉脫毛，無菌條件下制備2 cm ×2 cm 創面面積，按印跡剪去全層皮膚，深至筋膜，避開較大血管，造成缺損性創面，肌注氫化可的松60 mg/kg，50%冰醋酸溶液涂抹創面，醫用紗布覆蓋、包扎，1 周后形成慢性皮膚潰瘍模型。造模成功標準：大頭針刺創面5 mm，無滲血且潰瘍表面有肉芽組織生長［5］。選擇24 只造模成功大鼠，依據隨機數字表隨機分為模型組和紫草素組，每組12 只。12 只未造模大鼠作為假手術組，僅在背部相應部位分離皮瓣，原位縫合。

1.4 給藥方法

給藥時間為造模1 周后，給藥前均采用生理鹽水棉球清洗創面，擦拭分泌物。清潔后進行藥物干預，并用紗布覆蓋。模型組給予1 890 U/cm2重組牛堿性成纖維細胞生長因子凝膠涂抹創面，紫草素組給予4 mg/mL紫草混懸液（大豆油稀釋）涂抹，具體劑量參照“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”換算。假手術組和模型組給予等量生理鹽水外敷。每日換藥1次，連續給藥14 d。

1.5 觀察指標和方法

1.5.1 一般情況

每日觀察大鼠形態、體征、行為等一般情況。

1.5.2 創面愈合情況

分別在干預7、12 d 后觀察創面愈合情況，計算創面愈合率。玻璃紙覆蓋創面，描繪潰瘍邊緣，沿邊緣剪下后稱重，按面積比值計算潰瘍面積，由同一名醫師測量，測量3次取平均值。

創面愈合（%）=（干預前創面面積- 干預后創面面積）／干預前創面面積×100%

1.5.3 潰瘍創面病理組織學變化

干預7、12 d 后，無菌條件下采用手術器械分離潰瘍創面肉芽組織低溫凍存待檢，取部分組織進行石蠟切片、HE染色，顯微鏡下觀察病理變化。

1.5.4 Western Blot 法檢測潰瘍組織Cx26、Cx32、Cx43蛋白表達

干預12 d 后，取待檢潰瘍肉芽組織，冰上加入RIPA 裂解液，充分震蕩、離心后吸取上清液；PBS 洗滌剪塊勻漿，離心收集上清液，獲得總蛋白溶液。加入細胞漿蛋白抽提試劑A 和B，再次離心后獲得細胞漿蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度。經SDS－PAGE 電泳后在300 mA 恒流下轉膜，30 min 后使用5%脫脂牛奶封閉，4 ℃孵育稀釋后加入一抗，過夜后加入二抗，加入發光液之后進行曝光、顯影、定影。采用Alpha 軟件分析目標帶光密度值。

1.5.5 RT－PCR 法檢測潰瘍組織Cx26、Cx32、Cx43 mRNA相對表達

干預14 d 后取潰瘍肉芽待檢組織，充分研磨后分離蛋白，提取RNA，檢測RNA 濃度，逆轉錄后獲得cDNA。選擇20 μL 體系進行Real time－PCR 反應，cDNA 1.5 mmol/L。引物由武漢益普生物科技有限公司合成，反應條件：95 ℃變性15 s，60 ℃退火并結合到靶序列上，延伸1 min，擴增40 個循環。以GAPDH 作為內參，采用2－ΔΔCT法分析mRNA相對表達量。

1.6 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計軟件對實驗數據進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對樣本t檢驗，以P<0.05代表差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況

干預期間無大鼠死亡，各組大鼠體質量、活動度未見明顯變化。

2.2 各組大鼠創面愈合情況比較

與本組治療前比較，模型組、紫草素組大鼠干預12 d 后創面愈合率均高于7 d 后（P<0.05）；與模型組同時間比較，紫草素組干預7、12 d 后創面愈合率差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 各組大鼠干預7、12 d后創面愈合率比較（±s，%）

表1 各組大鼠干預7、12 d后創面愈合率比較（±s，%）

注：與本組干預7 d后比較，aP<0.05。

組別假手術組模型組紫草素組干預12 d—91.77±4.95a 93.03±2.26a n 12 12 12干預7 d—34.24±11.59 40.79±10.08

2.3 各組大鼠潰瘍創面病理學變化比較

假手術組大鼠皮膚組織在干預7、12 d后均有完整的皮膚結構，表皮、真皮、皮下組織，未見炎性細胞浸潤；模型組大鼠在干預7 d 后傷口組織沒有完整的結構，表皮缺失，傷口部位有大量炎性細胞浸潤、聚集；與模型組比較，紫草素組大鼠在干預7 d后表皮層和真皮層的細胞數明顯增多，皮層變厚，炎性細胞浸潤減少。模型組大鼠干預12 d后傷口仍沒有形成明顯完整的皮膚結構，炎性細胞浸潤減少；紫草素組大鼠干預12 d后已經有明顯的表皮形成，小鼠傷口愈合速度明顯優于模型組。見圖1。

圖1 各組大鼠潰瘍創面肉芽組織病理變化圖（HE，×200）

2.4 各組大鼠潰瘍創面Cx26、Cx30、Cx43蛋白表達情況比較

干預12 d 后，模型組、紫草素組Cx26、Cx30、Cx43蛋白均低于假手術組（P< 0.05）；紫草素組Cx26、Cx30、Cx43蛋白表達高于模型組（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠潰瘍創面Cx26、Cx30、Cx43蛋白表達比較（±s）

表2 各組大鼠潰瘍創面Cx26、Cx30、Cx43蛋白表達比較（±s）

注：與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

組別假手術組模型組紫草素組Cx43 1.04±0.22 0.36±0.09a 0.65±0.18ab n 12 12 12 Cx26 1.05±0.21 0.24±0.08a 0.43±0.10ab Cx32 1.02±0.25 0.40±0.11a 0.74±0.23ab

2.5 各組大鼠大鼠潰瘍創面Cx26、Cx30、Cx43 mRNA相對表達比較

干預12 d 后，模型組、紫草素組Cx26、Cx30、Cx43 mRNA 低于假手術組（P< 0.05）；紫草素組Cx26、Cx30、Cx43 mRNA高于模型組（P<0.05）。見表3。

表3 各組大鼠潰瘍創面Cx26、Cx30、Cx43mRNA相對表達比較（±s）

表3 各組大鼠潰瘍創面Cx26、Cx30、Cx43mRNA相對表達比較（±s）

注：與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

組別假手術組模型組紫草素組Cx43 0.98±0.17 0.43±0.11a 0.59±0.11ab n 12 12 12 Cx26 0.95±0.21 0.41±0.12a 0.65±0.17ab Cx30 1.02±0.09 0.48±0.10a 0.69±0.18ab

3 討論

中醫學認為，慢性皮膚潰瘍屬“頑瘡”“潰瘍”“褥瘡”等范疇，相關記載最早可見于《黃帝內經》。該病的病因無外乎內傷、外感。內傷或因飲食失節、勞力過度，外感多由各種原因造成的外傷和六淫之風、寒、暑、濕、燥、火［6－7］。中醫學對慢性皮膚潰瘍的治療具有豐富的經驗，主張清創、控制感染、改善血供、促進創面愈合等非手術治療手段［8］。

紫草是紫草科植物新疆紫草、紫草或內蒙紫草的干燥根，具有活血涼血、解毒透疹的功效［9］，在血熱毒盛、麻疹、瘡瘍的治療中具有獨特的療效［10］。紫草及紫草制劑現已廣泛用于臨床治療，用于濕疹、皮炎、皮膚創面及黏膜損傷等多種炎癥性疾病［11］。紫草素是從紫草中提取的主要成分，具有抗炎、殺菌等效果，也有研究證實其具有抗癌的作用［12］，常用于皮膚疾病的治療。

潰瘍創面愈合率是反映慢性皮膚潰瘍療效最直觀的證據［13］，在本次研究中，紫草素組干預7、12 d 后創面愈合率與模型組比較差異無統計學意義（P>0.05），證實其能夠有效促進慢性皮膚潰瘍愈合，治療效果與重組牛堿性成纖維細胞生長因子凝膠相當。從潰瘍創面肉芽組織HE 染色中可以看出，紫草素組肉芽組織生長良好，炎性細胞浸潤減少，進一步印證了紫草素對于慢性皮膚潰瘍的治療效果及其抗炎效果。

間隙連接是相鄰細胞進行物質和信息交換的跨膜蛋白通道［14］，主要由Cx構成。營養物質、代謝產物、分子量較小的親水性物質等均可以通過間隙連接進行交換［15］。間隙連接介導的細胞連接通訊是調控內環境穩定，細胞新陳代謝、增殖分化等生理過程的重要手段。Cx 基因也與多種皮膚病存在密切的聯系。Cx 的主要作用有細胞通道、電耦聯作用、調控細胞生長與分化及傳遞胚胎生長、發育中的細胞間信號［16］。Cx26、Cx30、Cx43是Cx家族的關鍵蛋白，其高水平表達說明細胞之間的信息和物質交換加快，有利于創面的愈合。相關研究也證實，Cx43 對于皮膚傷口愈合的速度和質量具有重要作用［17］。本次研究中，模型組、紫草素組Cx26、Cx30、Cx43 mRNA 和蛋白表達均低于假手術組，證實Cx26、Cx30、Cx43 在創面愈合中發揮了作用。紫草素組Cx26、Cx30、Cx43 mRNA 和蛋白表達均高于模型組，提示紫草素可能通過提高Cx 水平促進潰瘍皮膚的愈合，提高治療效果。

本次研究不足之處在于未對紫草素劑量水平展開研究，日后將繼續補充相關研究。

綜上所述，紫草素治療慢性皮膚潰瘍大鼠效果明顯，其作用機制可能與提高間隙連接蛋白水平有關。