異丙腎上腺素誘導恒河猴心肌損傷模型的初步研究

李艷艷,楊鳳梅,王俊斌,陳麗雄,靳瑋華,和占龍,楊 飛,趙 遠?

(1.中國醫學科學院/北京協和醫學院 醫學生物學研究所,云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室,昆明 650118;2.昆明市第三人民醫院胸外科,昆明 650041)

目前,心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是致人類死亡的最常見的病因之一,是嚴重威脅健康的頭號殺手[1]。動物模型作為研究心血管疾病的常用方法,對于揭示發病機制和評價干預效果極為重要。在心肌損傷動物模型的非臨床研究中,常見以大鼠、小鼠、兔、犬、小型豬等為報道多見[2]。但非人靈長類動物心肌損傷模型的研究報道極其少見。由于恒河猴(Macaca mulatta)在許多生理方面與人類非常相似,因此被認為是研究人類生理和發病機理的最有價值的非人靈長類動物模型[3]。對于心血管疾病,特別是心臟病的研究,恒河猴是人類的重要替代品。恒河猴的心臟結構與人類非常相似,冠狀動脈的分布與人類相似[4]。因此,恒河猴心肌損傷模型將為人類心臟疾病研究提供更好的替代方法。然而,恒河猴心肌損傷模型的一些詳細特征以及與人類心肌疾病的比較數據并無報道。

異丙腎上腺素(isoproterenol,ISO)是一種構建心臟疾病動物模型的常用藥物,通過加快心率、增強心肌耗氧量等引發心肌損傷,可導致大鼠出現許多與人類心臟病相似的代謝和形態學異常表現,如心肌損傷壞死、纖維化及心室重構,心臟功能下降。ISO可用于藥物性心肌損傷、缺血性心肌損傷、2型心肌梗死等疾病的模擬研究[5-7]。目前皮下注射ISO誘導建立心肌損傷動物模型相關的研究較多,但使用的注射劑量差別很大,且未見用于恒河猴誘導心肌損傷模型的相關報道。本研究的目的是在恒河猴皮下注射ISO誘導建立心肌損傷動物模型,為人類心臟疾病致病機理、藥物評價等提供基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康恒河猴11只,普通級,雄性,7～9歲,體重8～12kg,來源于中國醫學科學院醫學生物學研究所[SCXK(滇)K2020-0005],動物飼養在中國醫學科學院醫學生物學研究所[SYXK(滇)K2020-0008]。實驗操作及飼養在本單位實驗動物部實驗設施中進行。實驗經中國醫學科學院醫學生物學研究所倫理委員會審核批準(DWSP201810002)。實驗過程嚴格遵循3R原則和實驗動物福利倫理要求。

1.2 主要試劑與儀器

ISO(大連美侖生物技術有限公司,MB5204-5 g);注射用生理鹽水(昆明南疆制藥有限公司,A19122606A);AST(批號140219005)、ALT(批號140120001)、LDH(批 號142719006)、CK(批 號142519011)、CK-MB(批號142619006)等生化試劑(深圳邁瑞生物);溶血劑(批號R9538)、稀釋液(批號G0082)等血常規試劑(Sysmex);復方氯胺酮注射液(江蘇中牧倍康藥業有限公司,20200102)。

Apogee5300彩色多普勒超聲診斷儀(汕頭市超聲儀器研究所有限公司,中國);BS-200全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司,中國);IE12數字式心電圖機(深圳邦健生物醫療設備股份有限公司,中國);Microfuge20R臺式高速冷凍離心機(Thermo);XT-2000i全自動五分類動物血液細胞分析儀(Sysmex)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及實驗干預

實驗恒河猴分為3組:高劑量組(H組,n=4),低劑量組(L組,n=4),對照組(C組,n=3)。模型組動物大腿外側皮下注射ISO,H組每次注射ISO1 mL(4.6mg/kg),每天2次;L組每次注射ISO1mL(3.2mg/kg),每天2次;C組注射生理鹽水1mL,每天1次。連續注射5周。

1.3.2 臨床觀察

注射ISO后每天觀察記錄動物飲食,精神狀態、活動、毛色、糞便、死亡等情況。

1.3.3 心臟彩超檢查

分別于注射后第1、3、5、7天及第2、3、4、5周對所有動物進行彩色多普勒超聲影像檢查,將探頭放置在胸骨左緣心臟區域,M型超聲束經過二尖瓣腱索,與室間隔、左室后壁保持垂直,頻率為2.5MHz。分別測量左室舒張末期的室間隔厚度(IVSTd)、左室內徑(LVEDD)、左室后壁厚度(LVPWTd),收縮末期的室間隔厚度(IVSTs)、左室內徑(LVESD)、左室后壁厚度(LVPWTs)、及左心室短軸縮短率(FS,%)、射血分數(EF,%)、左心室質量(LVM,g)等心功能指標。

1.3.4 血液生化學檢測

分別于注射后第1、3、5、7天及第2～5周對所有動物采集全血,分離血清,進行谷丙轉氨酶(alanine amiotransferase,ALT)、谷 草 轉 氨 酶(aspartate aminotransferase,AST)、肌酸肌酶(creatine kinase,CK)、肌酸肌酶同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)等指標檢測。

1.3.5 血常規檢測

分別于注射后第1、3、5、7天及第2～5周對所有動物采集全血,進行血常規檢測,計算血小板/淋巴細胞比值(PLR)、中性粒細胞/淋巴細胞比值(NLR)。

1.3.6 心電圖檢測

分別于注射后第1、3、5、7天及第2～5周對所有動物進行心電圖檢查,記錄心電圖。

1.4 統計學方法

應用GraphPad Prism8軟件進行統計分析,結果均以平均數±標準差(±s)表示,采用方差分析進行組間比較,P＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結果

2.1 臨床觀察結果

恒河猴注射異丙腎上腺素后,飲水增加,呼吸頻率加快,前期活動減少,后期恢復正常;精神狀態未發生明顯改變,毛色、糞便正常,無死亡等情況。

2.2 心臟彩超結果

心臟超聲可以清晰顯示恒河猴心臟結構。由心臟彩超可見,給藥前心臟收縮節律正常,收縮有力,給藥后逐漸出現左室后壁收縮無力、活動減弱(如圖1A～1C);高、低劑量組左室內徑在給藥后的前1周出現增大的變化趨勢。室間隔厚度增寬;高劑量組左室后壁厚度在給藥3d后出現明顯的增寬。左心功能指標EF和FS降低。見圖2A～2I。

圖1 心臟彩超結果Figure1 Results of echocardiography

圖2 ISO對恒河猴左心室壁厚度及左心功能的影響Figure2 Effect of ISO on left ventricular wall thickness and left ventricular function in rhesus monkeys

2.3 血液生化學結果

對給藥后不同時間點的血清AST、ALT、LDH、CK、CK-MB檢測發現,H組AST、ALT、LDH、CK在第1天出現升高,第3天達到最高值,CK-MB在第1天即出現最高值,而后逐漸下降恢復至給藥前水平;H組AST在第3天顯著高于C組;H組ALT在第1天、第3天顯著高于L組;H組LDH在第1、3、5天顯著高于C組,第3、7天顯著高于L組,L組LDH在第5周顯著高于C組(P＜0.05)。見圖3A～3E。

圖3 ISO對恒河猴血液生化指標的影響Figure3 Effect of ISO on blood biochemical indexes of rhesus monkeys

2.4 血液常規結果

計算不同時間點的血小板/淋巴細胞比值(PLR)、中性粒細胞/淋巴細胞比值(NLR)得出,H組在給藥第1天PLR、NLR即出現明顯升高,PLR在第5天出現最高值,NLR在第1天出現最高值;L組PLR、NLR變化趨勢不明顯。見圖4A、4B。

圖4 ISO對恒河猴血液生理指標的影響Figure4 Effect of ISO on the blood physiological indexes of rhesus monkeys

2.5 心電圖結果

實驗前為正常心電圖,給藥后至第5周,持續出現T波、ST段不同程度改變,主要表現:ST段改變(II,III,avF,V4-V6導聯輕度下移),T波改變(I,avL,V1-V6導聯平坦,倒置,負正雙向)等,見圖5。

圖5 ISO對恒河猴心電圖的影響Figure5 Effect of ISO on the electrocardiogram of rhesus monkeys

3 討論

ISO是非選擇性β-腎上腺素受體激動劑,研究者普遍認可其具有誘發心室重構的作用,并得到廣泛應用。炎癥反應、內質網應激、氧化應激、自噬和凋亡等機制的相互聯系、影響,直接和間接造成ISO性心肌損傷。ISO常用于建立病理性心肌損傷、心肌肥厚、心肌梗死和心力衰竭等實驗動物模型[8]。此法操作簡單、模型穩定、成本低,已成為大鼠心肌肥大動物模型建立的常用方案之一[9]。目前,有關恒河猴心肌損傷模型建立的報道較少。為探討不同劑量對恒河猴心肌損傷模型構建的影響,本研究通過采用皮下注射高、低劑量的ISO誘導建立恒河猴心肌損傷模型。結果發現,兩種劑量ISO處理后,恒河猴心臟均出現不同程度的損傷,但高劑量組各種指標變化更為明顯。高劑量組在處理后的1周內出現心肌收縮活動減弱及心電圖異常情況。另外,高、低劑量組恒河猴心臟IVSTd、IVSTs、LVEDD、LVESD、LVPWTd、LVPWTs表現為不同程度的增加,心功能指標EF、FS降低,高劑量組LVM在處理2周后出現明顯增加。

AST主要存在于心肌中,機體健康狀態下,血清中AST水平較低。細胞損傷時,細胞膜通透性增加,AST從胞漿內釋放入血液。同時,炎癥因子釋放,心肌損傷進一步加劇[10]。ISO通過影響Ca2+通道,導致心肌收縮變強,需氧量增加,進而引起DNA、蛋白質和膜脂質等細胞組分氧化,直接損傷心肌[8]。血清心肌酶CK-MB、LDH的水平可反映心肌損傷情況[11]。CK同工酶的CK-MB,主要存在于心肌細胞質中,能催化能量轉化,為肌肉收縮提供直接的能量來源[12-13]。當ISO致使脂質膜破壞,大量CK-MB釋放進入血液,而血清中CK-MB含量與心肌損傷程度正相關,能敏感反映心肌損傷的程度[14]。LDH廣泛分布在各種組織的細胞質中,以心、腎、骨骼肌最為豐富。當少量心肌細胞膜發生破壞,或心肌組織損傷、壞死時,血清中LDH活性即可升高[15]。本研究中,高劑量組AST、CK-MB、LDH等指標均在處理后1～5d內出現明顯增加,較低劑量組更早出現變化。該變化規律反映出高劑量組能更好的誘導恒河猴出現心肌損傷樣的血液學指標變化。

近年,NLR與各種心血管疾病的臨床結局相關性已得到證實。其作為一種全身性炎性標志物即可直觀反映炎癥情況,又能反映免疫水平,更穩定地反映機體的炎癥狀態。中性粒細胞釋放氧自由基,激活產生大量炎癥介質,使血小板聚集率增加,導致血液持續高凝狀態[16],增加心肌損傷面積。同時,作為心肌細胞損傷的主要途徑,參與缺氧損傷、蛋白水解酶和其他炎癥過程[17-18]。國外一項研究報告,PLR是綜合血液凝聚與炎癥通路于一體的炎癥指標,是多種疾病狀態下出現不良心血管事件的危險因素[19]。另有文獻報道,心肌損傷患者的PLR值顯著高于無心肌損傷患者[20]。本研究中,H組在給藥第1天PLR、NLR即出現明顯升高,PLR在第5天出現最高值,NLR在第1天出現最高值;L組PLR、NLR變化趨勢不明顯。PLR、NLR與CK-MB、LDH等指標變化規律一致,推測高劑量組較低劑量組出現更為嚴重的心肌損傷。

心電圖是應用心電圖機在體表記錄心臟每個心動周期產生的電活動變化圖形的技術,是臨床上篩查和診斷心律失常和心血管疾病的最常用的檢查技術之一,具有非侵入性、較強抗干擾能力、記錄清晰、操作簡便、經濟有效等優點。心電圖結果顯示,給藥后至第5周,持續出現T波、ST段不同程度的改變,給藥初期(1～5d),ST段壓低,這與心肌缺血和心肌損傷有關,1周后出現ST段抬高,T波倒置,I、avL、V1-V6導聯、倒置,呈負正雙向(見圖5)。從心電圖特征性表現可以初步判斷為心肌損傷。

本文對不同劑量ISO誘導恒河猴心肌損傷模型進行初步探討,通過觀察恒河猴心臟彩超、心電圖的變化、以及AST、ALT及炎癥因子LDH、CK、CKMB、PLR、NLR等指標水平的變化,高劑量的ISO可成功誘導恒河猴心肌損傷;心臟超聲、心電圖及血液學的指標可作為恒河猴無創心臟損傷模型綜合評價的依據。