改良后Hulth法和Ⅱ型膠原酶注射法建立兔膝骨關節炎模型的比較研究

歐寶芳,別亞男,陳千晴,陳柏羽,許佳歡,謝水林,吳少瑜?

(1.南方醫科大學藥學院,廣州 510515;2.廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院,廣州 5114362;3.華南理工大學生物科學與工程學院,廣州 510006)

膝骨關節炎(KOA)是一種常見的以關節軟骨退變為特征的致殘性疾病[1],2000年1月至2019年12月我國40歲及以上人群膝骨關節炎患病率為20.50%[2]。炎癥引起的軟骨細胞紊亂、細胞外基質分解及關節不穩定是KOA發生的主要誘因[3]。目前大部分治療方法只能緩解疾病癥狀,未能修復關節軟骨組織,因此建立KOA動物模型對研究其發病機制及治療方式具有重要意義。

目前常用的KOA造模方法有Hulth法[4]、改良后Hulth法[5]、ACLT[6]、關節腔內注射藥物(包括膠原酶[7]、碘乙酸鹽[8]、木瓜蛋白酶[9])、關節制動[10]等。KOA造模常用的動物載體有大鼠、小鼠、家兔、豚鼠、犬、豬等[11]。改良后Hulth法和關節腔內注射Ⅱ型膠原酶法兩種方法都較為常用,但尚未有研究報道比較兩種造模方法之間的差異。本研究旨在分析比較兩種造模方法之間的異同點,為不同類型膝骨關節炎動物模型的選擇提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級健康成年新西蘭雄性大白兔9只,6月齡,體重2.5～2.7kg,由南方醫科大學實驗動物中心提供[SCXK(粵)2016-0041]。所有新西蘭大白兔購入后飼養于廣州華騰生物醫藥科技有限公司[SYXK(粵)2020-0237],分籠獨立飼養,動物可自由進食及飲水,環境溫度維持在20℃～25℃,濕度維持在40%～60%,模擬自然光照12h/d。動物實驗及研究過程遵循3R原則,給予動物人道主義關懷,并得到了廣州華騰生物醫藥科技有限公司實驗動物倫理委員會的批準(HTSW201003)。

1.2 主要試劑與儀器

速眠新Ⅱ(敦化市圣達動物藥品有限公司,20210301);Ⅱ型膠原酶(美國Sigma公司);EDTA脫鈣液(北京索萊寶科技有限公司);蘇木素(美國Sigma公司);伊紅染液(天津光復精細化工有限公司);番紅O-固綠染液(武漢賽維爾生物科技有限公司);兔TNF-α酶聯免疫分析試劑盒(CUSABIO,武漢華美生物工程有限公司);兔IL-1β酶聯免疫分析試劑盒(H002,南京建成生物工程研究所有限公司)。C型臂X射線儀(GE9900,美國通用電氣公司);微計算機斷層掃描(Micro-CT80476,荷蘭MILabs公司);組織切片機(RM2245,上海徠卡Leica公司);光學顯微鏡(舜宇光學科技(集團)有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 兔膝骨關節炎模型分組及構建

9只新西蘭大白兔隨機均分為以下3組:空白組、改良后Hulth組、Ⅱ型膠原酶組。術后1周開始驅趕各組動物進行運動,每天30min。

改良后Hulth組:采用改良后Hulth法[12]構建兔膝骨關節炎模型。固定家兔后,0.1mL/kg速眠新Ⅱ(生理鹽水1∶1稀釋)臀部肌肉注射鎮靜,再3%戊巴比妥鈉30mg/kg耳緣靜脈麻醉。將兔仰臥位固定在無菌手術臺上,備皮消毒鋪巾,沿髕韌帶內側做長約3cm縱行切口,逐層切開皮膚、筋膜層和關節囊,將髕骨外翻,將兔右腿屈膝45°后切斷內側副韌帶和前交叉韌帶,剔除內側半月板,行抽屜試驗確認前交叉韌帶完全斷裂。用生理鹽水清洗關節腔后復位髕骨,可吸收縫線逐層縫合。術后予青霉素臀部肌肉注射預防感染,連續3d,每次80萬單位。

Ⅱ型膠原酶組:于實驗第1、4天按上述方法麻醉兔后進行備皮消毒,將兔膝關節屈曲45°,于髕韌帶內側凹陷處進針,當出現落空感時,表明已進入關節腔內,注射0.5mL(4mg/mL)Ⅱ型膠原酶溶液(經0.22μm無菌過濾器過濾)。注射結束后用棉球壓住注射針眼處并再次屈伸膝關節使Ⅱ型膠原酶溶液充分浸潤至整個關節腔內。注射過程嚴格按照無菌操作要求。

1.3.2 Lequesne MG評分

術后1周開始用國際骨關節炎Lequesne MG指數[13]作為模型評定標準之一,每周進行2次Lequesne MG評分,持續6周。包括疼痛刺激反應程度、步態、關節活動范圍和關節腫脹程度4個方面,每部分分為4個等級,Ⅰ級為0分,Ⅱ級為1分,Ⅲ級為2分,Ⅳ級為3分,總分大于等于3分為造模成功。

1.3.3 X-ray

使用C型臂X射線儀(GE9900)對術后6周的各組兔進行影像學評估,透視千伏電壓和管電流分別設置為54kVp,1.04mA。兔麻醉后仰臥位放置于手術臺上,右膝關節伸直位拍攝正位片,即腓骨小頭橫徑1/3～2/3與脛骨重疊;屈膝30°拍攝膝關節側位片,即股骨內側髁與外側髁重疊,邊緣間距小于1.5cm[14]。

1.3.4 Micro-CT

使用Micro-CT對術后6周各組兔的膝關節進行斷層掃描,通過重建三維圖像來顯示骨組織在空間的分布,掃描電壓和電流分別設置為100kV和200μA,掃描后進行重建,重建的圖像分辨率為16 μm。對兔實行安樂死后,在兔膝關節上下3cm處用銳利器械切斷,將股骨髁和脛骨平臺取下,4%多聚甲醛內固定48h后拍攝Micro-CT。

1.3.5 兔膝關節大體觀察及Pelletier評分

各組兔于術后6周安樂死后,按構模手術入路切開膝關節囊,肉眼大體觀察右后膝關節軟骨并采用Pelletier評分[15]評估軟骨損傷情況:(1)0分:關節面完整,色澤如常;(2)1分:關節面粗糙,有小的裂隙且色澤灰暗;(3)2分:關節面糜爛,軟骨缺損深達軟骨表中層;(4)3分:關節面潰瘍形成,缺損深達軟骨深層;(5)4分:軟骨剝脫,軟骨下骨質暴露。

1.3.6 HE染色觀察關節軟骨組織形態變化

兔膝關節4%多聚甲醛中固定48h,EDTA脫鈣液37℃脫鈣3周后,取股骨內髁、股骨外髁、脛骨內髁和脛骨外髁的軟骨中央區繼續脫鈣1周,經脫水,石蠟縱向包埋后切成2μm的切片,并用蘇木素和伊紅染液進行染色,光學顯微鏡下觀察病變情況。

1.3.7 番紅O-固綠染色 及Mankin評分

兔膝關節石蠟切片后經番紅O和固綠染液染色,光學顯微鏡下觀察病變情況,并對番紅O-固綠染色結果進行Mankin評分[16],包括軟骨結構、軟骨細胞、基質染色、潮線完整性4個方面。

1.3.8 ELISA檢測兔血清炎性因子水平

各組兔于術后6周耳緣靜脈采血,收集于促凝管中,4℃靜置30min后,3000r/min離心10min收集上清。根據試劑盒說明書檢測血清中TNF-α和IL-1β的含量。

1.4 統計學方法

實驗數據應用IBM SPSS25.0進行分析。正態或近似正態分布的計量資料使用平均數±標準差(±s)進行統計描述,偏態資料使用中位數(四分位間距)[M(IQR)]進行統計描述。采用單因素方差分析、重復測量方差分析和Kruskal-Wallis H檢驗進行組間差異分析,采用LSD-t檢驗、Dunn’s檢驗進行組間多重比較。結果均以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組兔膝關節一般情況觀察

改良后Hulth法模型組的右側膝關節內側伴有骨性突出,質地堅硬;膠原酶模型組右側膝關節處未發現骨性變化,但伴有肌肉松弛的情況(圖1A)。兩種造模方法患肢均出現奔跑時輕度跛行,膝關節輕度腫脹,骨性標記變淺,Lequesne MG評分都顯著高于空白組(P＜0.01),改良后Hulth法模型組評分高于膠原酶模型組(P＜0.01)(圖1B)。

圖1 3組兔膝關節外觀形態及Lequesne MG評分結果(n=3)Figure1 Appearance and Lequesne MG score results of the knee joint in three groups

2.2 3組兔膝關節影像學情況觀察

X-ray顯示改良后Hulth法模型組的膝關節間隙變窄,膝關節內側有骨贅形成,未見游離體生成;膠原酶模型組X-ray征象則并不明顯(圖2A)。Micro-CT評估軟骨下骨質的微小變化(圖2B),Micro-CT平掃顯示,相比于空白組,兩組模型組均出現軟骨下骨硬化,主要表現為骨小梁增粗增多,三維重建結果顯示兩組模型組均存在骨重建,骨畸形,改良后Hulth法模型組有明顯的骨贅增生和骨刺形成。

圖2 3組兔膝關節X-ray和Micro-CT結果Figure2 X-ray and Micro-CT results of the knee joint in three groups

2.3 3組兔膝關節軟骨大體觀察

空白組的軟骨表層光滑平整,呈透亮有光澤的藍白色,無裂紋及缺損。改良后Hulth法模型組顯示在軟骨的中央區,關節軟骨面異常粗糙,軟骨表面缺損并伴有骨贅形成,關節腔可見淡黃色積液。膠原酶模型組軟骨表面缺損粗糙,無光澤,磨損嚴重,但未見骨贅生成(圖3A)。與空白組相比,兩種方法建立的模型組的Pelletier評分顯著升高(P＜0.05),但兩組模型組相比Pelletier評分無統計學差異(P＞0.05)(圖3B)。

圖3 3組兔膝關節軟骨大體觀察及Pelletier評分結果(n=3)Figure3 General observation and Pelletier score results of knee cartilage in three groups

2.4 3組兔膝關節病理切片觀察軟骨組織形態

HE染色結果顯示,空白組關節軟骨表面平整光滑,表面區、移行區、輻射區和礦化區四層結構清晰,排列規律,細胞分布及染色均勻,潮線完整,無血管通過。改良后Hulth法模型組關節軟骨表面損毀嚴重,軟骨層脫落,各結構層次紊亂。股骨內外髁裂隙深達輻射區,可見大量軟骨細胞克隆,細胞分布及排列不規律,總數減少,潮線扭曲前移并且伴有血管長入。膠原酶模型組軟骨表面較平整少裂隙,軟骨細胞排列紊亂,數量減少,大量炎性細胞浸潤,并伴隨大量血管通過(圖4)。

圖4 三組兔膝關節軟骨HE染色Figure4 HE staining of knee cartilage in three groups

番紅O-固綠染色結果與HE染色結果一致,空白組關節軟骨基質呈紅色,細胞核和膠原纖維呈綠色,潮線清晰規律,軟骨和軟骨下骨界限清晰,紅綠色對比明顯。兩組模型組軟骨基質區均出現番紅O染色減退甚至染色丟失,固綠染色明顯,局部出現細胞成簇現象(圖5)。

圖5 三組兔膝關節軟骨番紅O-固綠染色Figure5 Safranin O-Fast Green staining of knee cartilage in three groups

與空白組相比,兩組模型組軟骨Mankin評分較高(P＜0.01)。改良后Hulth法模型組Mankin評分從脛骨到股骨,外側到內側逐漸升高,顯示股骨區軟骨退變更嚴重。膠原酶模型組則脛骨區軟骨退變更嚴重(圖6)。

圖6 Mankin評分結果(n=3)Figure6 Mankin score results of knee cartilage in three groups

2.5 3組兔血清中TNF-α和IL-1β的表達水平比較

ELISA檢測結果顯示,兩組模型組的TNF-α和IL-1β水平均高于空白組(圖7和表1,P＜0.05),膠原酶模型組的TNF-α水平高于改良后Hulth法模型組(圖7A)。

圖7 三組兔血清中TNF-α和IL-1β表達水平結果(n=3)Figure7 Results of TNF-α and IL-1β expression level in serum of three groups of rabbits

表1 三組兔血清中TNF-α和IL-1β的表達水平比較Table1 Comparison of the expression levels of TNF-α and IL-1β in three groups of rabbit serum

3 討論

疾病動物模型是重大疾病機制研究、新型治療方式開發、藥物篩選與評價不可或缺的支撐條件[17]。理想的疾病動物模型至少需滿足與人類疾病相似的3個一致性特征:疾病發病機理同源性、行為表象一致性、藥物治療反應性[18]。目前用作KOA模型的動物載體有大小鼠、兔、豬和非人靈長類動物。其中家兔的關節結構與人類似,關節腔體積較小鼠更大,關節和組織更易提取[19],是早期骨關節炎模型的適宜載體。構建兔KOA模型的方法也多種多樣,主要有:(1)手術造模法;(2)自發性骨關節炎模型;(3)關節腔藥物誘導法;(4)關節制動法。

改良后的Hulth法[20]是最常用的關節內手術造模法之一,通過將膝關節韌帶等維持穩定的組織切斷或切除,使關節出現不同程度的穩態失衡,其在傳統的Hulth法的基礎上進行改良,即切斷前交叉韌帶、內側副韌帶和切除內側半月板,減小對動物的損傷,能較好地觀察KOA周圍組織早中期的病理表現,是KOA研究中最常用到的手術類模型。

關節腔藥物誘導法是直接在關節腔內注射能誘導炎癥的化合物或藥物,造成關節軟骨、半月板或韌帶的局部損傷。這種KOA模型具有實驗周期短、重復性好、創傷性小、便于操作的優點,能避免手術法易造成的感染問題[21]。

本研究成功構建了使用改良后的Hulth法或關節腔注射膠原酶誘導的兔KOA模型,并通過多種實驗檢測方法比較兩種造模方法的異同點。兩種造模方法的動物體重在術后均出現降低,1周后體重恢復穩步增長趨勢。Pelletier評分主要反映關節軟骨表面的退變程度[15],如關節面磨損、缺損的程度。兩種造模方法的兔關節軟骨均出現一定程度的粗糙和缺損,這與Ge等[22]的結果一致。改良后Hulth法模型組可見膝關節內側伴有骨性突出,X線及Micro-CT可見明顯的骨贅形成。膠原酶組肉眼未見骨性突出,患側肌肉松弛和萎縮并不在Lequesne MG評分標準內,故其評分稍低于改良后的Hulth組,且膠原酶以誘導軟骨退變為主,故X線及Micro-CT未見明顯變化。

軟骨組織病理學是評價KOA模型是否成功的主要指標[23]。在組織形態學方面多使用光學顯微鏡進行觀察,HE為常規的染色手段,另外還有針對于軟骨基質的特殊染色[24]。本研究利用番紅O-固綠染色結合Mankin軟骨組織形態學評分對關節軟骨進行病理學評估,結果顯示改良后Hulth法的病理損傷主要在股骨髁部,表現為嚴重的軟骨脫落和軟骨基質丟失,其原因應與手術造成的關節內側聯合不穩定有關[25];膠原酶法的病理損傷主要在脛骨平臺,主要表現為軟骨細胞凋亡和軟骨基質丟失,這與關節腔內注射時的進針位點有關[26]。

在KOA發展中,炎性因子參與破壞關節內微環境的穩態[27]。TNF-α是一種多功能炎性因子,是誘導KOA軟骨細胞凋亡的主要細胞因子[28],能刺激細胞生成PGE2和IL-1β,引起關節疼痛和抑制軟骨蛋白多糖合成[29]。

綜上,改良后Hulth法構建的KOA模型主要表現為骨贅生成、股骨髁部軟骨脫落和大量軟骨細胞克隆形成,軟骨損傷程度更為嚴重;關節腔注射膠原酶誘導的KOA模型主要表現為軟骨表面缺損,脛骨平臺軟骨基質丟失和炎性因子升高,相比于改良后的Hulth法更為簡便,創傷性小,更接近人的KOA進程與發病機制,研究者可根據實驗的具體要求,采用最合適的造模方法。