七氟醚調(diào)控NRF2/HO-1/HMGB1通路減輕缺氧誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)

溫翔宇,張軍宏,朱存良

(1.甘肅省定西市人民醫(yī)院麻醉科,甘肅 定西 743000;2.甘肅省定西市人民醫(yī)院泌尿外科,甘肅 定西 743000;3.湖南省婁底市中心醫(yī)院,湖南 婁底 417000)

小膠質(zhì)(microglia cells,MG)細(xì)胞可調(diào)節(jié)大腦發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和修復(fù),被稱為大腦巨噬細(xì)胞[1]。MG也是神經(jīng)炎癥反應(yīng)關(guān)鍵介質(zhì),缺血、缺氧或炎癥刺激狀態(tài)下激活MG,可清除壞死組織并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,但MG過(guò)度活化及死亡會(huì)釋放大量炎性介質(zhì),并導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生不可逆損傷[2-3]。探究MG活化及其活化后炎癥反應(yīng)機(jī)制,對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療具有一定臨床意義。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(transcription factor NF-E2 related factor2,NRF2)/血紅素加氧酶1(heme oxygenase1,HO-1)通路可參與機(jī)體抗氧化應(yīng)激反應(yīng),并能通過(guò)抑制下游炎癥通路高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)通路表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗炎反應(yīng),進(jìn)而參與多種疾病生理過(guò)程[4-5]。但NRF2/HO-1/HMGB1通路參與MG炎癥反應(yīng)過(guò)程的研究較少。目前臨床常用麻醉劑-七氟醚能夠促進(jìn)MG活化,并抑制炎癥反應(yīng)來(lái)緩解創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦損傷進(jìn)程[6],但有研究顯示七氟醚能夠誘導(dǎo)MG活化并促進(jìn)其炎癥反應(yīng)[7]。因此對(duì)七氟醚的作用仍存在爭(zhēng)議。本研究體外培養(yǎng)MG,并給予缺氧及七氟醚處理,以期驗(yàn)證七氟醚對(duì)MG活化及炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用,并從NRF2/HO-1/HMGB1通路闡明其調(diào)控炎癥反應(yīng)的分子生物學(xué)機(jī)制,為神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

BV-2小鼠MG細(xì)胞(貨號(hào):YCL-0493,武漢益普生物科技有限公司)。

1.2 主要試劑與儀器

七氟醚(批號(hào):H20040772,美國(guó)Abbott公司);NRF2、HO-1、HMGB1、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)等抗體(貨號(hào):ab156883、ab189491、ab32536、ab79523、ab239882、ab234437,美國(guó)abcam)。麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀(型號(hào):Capnomac Datex AS/3,芬蘭Datex.Ohmeda公司);光學(xué)顯微鏡(型號(hào):SMZ745,日本尼康公司);化學(xué)發(fā)光儀(型號(hào):GIS-500,杭州米歐儀器公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

取BV-2小鼠MG細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)復(fù)蘇后,置于5% CO2、37℃、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中,用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。每2d更換1次培養(yǎng)基,5d后傳代進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞分組與處理

取細(xì)胞制備成每升5×108個(gè)的細(xì)胞懸液接種至96孔板上,每孔100μL,用無(wú)血清培養(yǎng)基孵育6～12h,貼壁同步化后換用含血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),并進(jìn)行如下分組處理:(1)置于缺氧培養(yǎng)箱(37℃、95% N2、5% CO2混合氣體)中進(jìn)行培養(yǎng),并設(shè)置缺氧不同時(shí)間(0、2、4、6、8、12h)組,各組均在缺氧條件下處理后,置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞活化形態(tài),并檢測(cè)細(xì)胞活化比例及NRF2、HO-1、HMGB1、IL-1β蛋白表達(dá)水平,選出最佳缺氧時(shí)間8h;(2)設(shè)置七氟醚不同濃度(0、2%、4%、6%)組,并置于兩側(cè)各有一小孔的密閉容器中,一側(cè)小孔接麻醉機(jī),輸入氧氣(2mL/min)和七氟醚,另一側(cè)小孔端接麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀測(cè)定七氟醚濃度達(dá)0、2%、4%、6%后,維持30min后,置于缺氧培養(yǎng)箱中缺氧8h,檢測(cè)細(xì)胞活化比例及NRF2、HO-1、HMGB1、IL-1β蛋白表達(dá)水平;(3)設(shè)置正常對(duì)照組、缺氧誘導(dǎo)組、6%七氟醚組、SnPP組[NRF2/HO-1通路抑制劑-錫原卟啉(Sn-protoporphyrin,SnPP)]、6%七氟醚+SnPP組;除正常對(duì)照組外,其余各組均置于缺氧條件下培養(yǎng)8 h;6%七氟醚組在缺氧前給予6%七氟醚處理30 min;SnPP組在缺氧處理前參照文獻(xiàn)[8]向培養(yǎng)基中加入終濃度為5μmol/L的SnPP;6%七氟醚+SnPP組加入SnPP并進(jìn)行6%七氟醚處理30min后進(jìn)行缺氧誘導(dǎo)。檢測(cè)細(xì)胞活化比例及相關(guān)蛋白表達(dá)水平。

1.3.3 活化細(xì)胞比例檢測(cè)

收集1.3.2項(xiàng)下各組細(xì)胞,置倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。每組取3個(gè)不同視野計(jì)數(shù),重復(fù)3次。MG活化細(xì)胞比例=(多極型細(xì)胞數(shù)量+紡錘樣雙極細(xì)胞數(shù)量)/總細(xì)胞數(shù)量×100%。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)

收集1.3.2項(xiàng)下的各組細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液抽提總蛋白后,采用二喹啉甲酸法檢測(cè)總蛋白濃度;將變性后的蛋白樣品行電泳及轉(zhuǎn)膜反應(yīng)后;脫脂奶粉封閉聚偏氟乙烯膜2h后,加入一抗(NRF2、HO-1、HMGB1、IL-1β、NF-κB p65、p-NF-κB p65抗體,稀釋倍數(shù)為1∶1000,內(nèi)參抗體為GAPDH,稀釋倍數(shù)為1∶2000),在4℃下孵育過(guò)夜;次日,加入稀釋5000倍的二抗于室溫下孵育1h。顯影曝光后,化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)拍照并分析灰度值。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組比較行t檢驗(yàn);多組間比較行單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn);P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞形態(tài)、活化比例及NRF2、HO-1、HMGB1、IL-1β表達(dá)的影響

缺氧0h時(shí)MG呈圓形或者橢圓形,隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng),MG體積增大,出現(xiàn)多極或兩極延長(zhǎng),分支樣或紡錘樣改變的細(xì)胞逐漸增多。與缺氧0h相比,缺氧2、4、6、8、12h活化細(xì)胞比例、HMGB1、IL-1β蛋白表達(dá)增多(P＜0.05);NRF2、HO-1蛋白表達(dá)在缺氧2h時(shí)迅速升高,4h時(shí)迅速下降,并在8～12 h時(shí)下降至最低水平(P＜0.05)。缺氧8h后活化細(xì)胞比例最多,8h與12h相比,上述指標(biāo)變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見(jiàn)圖1～3。

圖1 不同缺氧時(shí)間下MG形態(tài)變化圖Figure1 Morphological changes of MG under different hypoxia time

圖2 各組細(xì)胞NRF2、HO-1、HMGB1、IL-1β蛋白表達(dá)免疫印跡圖

圖3 各組細(xì)胞NRF2、HO-1、HMGB1、IL-1β表達(dá)及活化細(xì)胞比例比較Figure3 Comparison of expression levels of NRF2,HO-1,HMGB1,IL-1β and activated cell proportion in each group

2.2 七氟醚不同濃度處理對(duì)MG活化比例及NRF2、HO-1、HMGB1、IL-1β蛋白表達(dá)的影響

七氟醚濃度為0時(shí),MG體積增大,細(xì)胞分支樣或紡錘樣改變的細(xì)胞較多。與0七氟醚處理組相比,2%、4%、6%七氟醚處理組活化細(xì)胞比例、HMGB1、IL-1β蛋白表達(dá)減少(P＜0.05),NRF2、HO-1蛋白表達(dá)升高(P＜0.05),且呈劑量依賴性,見(jiàn)圖4～7。

圖4 各組MG形態(tài)變化圖Figure4 Morphological changes of MG in each group

圖5 各組MG活化細(xì)胞比例比較(±s,n=6)Figure5 Comparison of MG activated cell proportion in each group

圖6 各組細(xì)胞NRF2、HO-1、HMGB1、IL-1β蛋白表達(dá)免疫印跡圖Figure6 Western blot of NRF2,HO-1,HMGB1and IL-1β expression in each group

圖7 各組細(xì)胞NRF2、HO-1、HMGB1、IL-1β蛋白表達(dá)比較(±s,n=6)Figure7 Comparison of protein expression of NRF2,HO-1,HMGB1and IL-1β in each group

2.3 6%七氟醚與SnPP聯(lián)合應(yīng)用后對(duì)MG活化、NRF2、HO-1、HMGB1及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較,缺氧誘導(dǎo)組活化細(xì)胞比例、HMGB1、IL-1β、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)升高,NRF2、HO-1蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)。6%七氟醚組上述指標(biāo)變化與缺氧誘導(dǎo)組相反(P＜0.05);SnPP組上述指標(biāo)變化與缺氧誘導(dǎo)組一致且比缺氧誘導(dǎo)組變化更明顯(P＜0.05)。6%七氟醚+SnPP組上述指標(biāo)變化與6%七氟醚組相反(P＜0.05),見(jiàn)圖8～11。

圖8 各組MG形態(tài)變化圖Figure8 Morphological changes of MG

圖9 各組MG活化細(xì)胞比例比較(±s,n=6)Figure9 Comparison of the proportion of MG activated cells in each group

圖10 各組細(xì)胞NRF2、HO-1、HMGB1、IL-1β蛋白表達(dá)免疫印跡圖Figure10 Western blot of NRF2,HO-1,HMGB1and IL-1β expression in each group

圖11 各組細(xì)胞NRF2、HO-1、HMGB1、IL-1β蛋白表達(dá)比較(±s,n=6)Figure11 Comparison of relative protein expression levels of NRF2,HO-1,HMGB1and IL-1β in each group

3 討論

MG過(guò)度活化介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),是神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因之一[9]。缺血缺氧、炎癥、感染等病理刺激均可激活MG,使MG由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)而表現(xiàn)出促炎功能[10]。本研究于37℃、5% CO2條件下模擬MG缺氧條件,發(fā)現(xiàn)缺氧(0、2、4、6、8、12h)條件下,MG出現(xiàn)分枝樣或紡錘樣改變,且MG活化細(xì)胞比例及促炎因子IL-1β釋放在缺氧(2、4、6、8h)內(nèi)隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,并在8～12h內(nèi)稍有下降,與參考文獻(xiàn)[11]MG活化狀態(tài)下的形態(tài)改變及參考文獻(xiàn)[12]缺氧條件IL-1β的水平變化一致,表明缺氧8h可穩(wěn)定建立MG過(guò)度活化及炎癥反應(yīng)模型。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn),NRF2/HO-1/HMGB1通路是參與機(jī)體氧化及炎癥反應(yīng)的經(jīng)典通路之一,Yu等[13]發(fā)現(xiàn)敲除NRF2基因后,NRF2下游靶基因HO-1介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)減弱,NRF2調(diào)控的炎癥復(fù)合體-NOD樣受體蛋白3(NLRP3)激活,促進(jìn)HMGB1/NF-κB調(diào)控的炎癥通路活化,從而加重膿毒癥小鼠肺組織炎癥損傷進(jìn)程。Tan等[5]研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞中核因子NRF2的核易位可誘導(dǎo)HO-1表達(dá),而用HO-1抑制劑SnPP能逆轉(zhuǎn)NRF2/HO-1途徑的激活,使脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中NF-κB p65核轉(zhuǎn)移增多,促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放大量的促炎介質(zhì)HMGB1、IL-1β等而加重炎癥反應(yīng),提示NRF2/HO-1/HMGB1途徑可能是炎癥反應(yīng)的重要途徑之一。但MG過(guò)度活化介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過(guò)程中是否有NRF2/HO-1/HMGB1途徑的參與,還不甚明確。本研究結(jié)果顯示,隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng),NRF2、HO-1蛋白表達(dá)持續(xù)降低,而促炎介質(zhì)HMGB1的釋放也逐漸升高,且NRF2、HO-1及HMGB1水平均于缺氧8h時(shí)處于穩(wěn)定狀態(tài),表明NRF2/HO-1/HMGB1途徑參與缺氧誘導(dǎo)的MG活化及炎癥反應(yīng)過(guò)程。

近年來(lái)MG介導(dǎo)的慢性神經(jīng)炎癥反應(yīng)越來(lái)越受到臨床及患者的重視[14]。尋找特異性抑制MG過(guò)度活化及炎癥反應(yīng)的藥物,來(lái)緩解和治療神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病,也是廣大學(xué)者研究的重要任務(wù)[15]。七氟醚為臨床常用麻醉藥,能夠通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷緩解腦、腎、肺等多個(gè)臟器的缺血灌注損傷[16],且張國(guó)棟等[6]及趙丹等[17]研究發(fā)現(xiàn)七氟醚能通過(guò)抑制腦缺血再灌注誘發(fā)的MG活化,來(lái)抑制大鼠腦組織炎癥及氧化應(yīng)激損傷而保護(hù)腦神經(jīng),提示七氟醚可能是抑制MG活化的有效藥物之一。但陳穎等[7]及趙敏等[18]離體培養(yǎng)MG后研究結(jié)果顯示七氟醚能誘導(dǎo)MG活化并促進(jìn)炎癥反應(yīng)及Dang等[19]在體研究顯示七氟醚能促進(jìn)MG活化,與張國(guó)棟等[6]及趙丹等[17]七氟醚研究機(jī)制相反。七氟醚是促進(jìn)還是抑制MG活化及炎癥反應(yīng)的機(jī)制仍存在爭(zhēng)議。

本研究用缺氧處理8h模擬MG活化及炎癥反應(yīng)狀態(tài)后,用七氟醚不同濃度(2%、4%、6%)進(jìn)行干預(yù)發(fā)現(xiàn),隨七氟醚濃度升高,MG分枝樣或紡錘樣等活化狀態(tài)改變明顯減輕,MG活化細(xì)胞比例及IL-1β釋放也呈劑量依賴性降低且均顯著低于0七氟醚處理組,提示七氟醚能夠抑制缺氧條件下MG活化及炎癥反應(yīng),這與Yu等[20]七氟醚抑制脂多糖誘導(dǎo)的MG活化發(fā)揮抗炎反應(yīng)機(jī)制一致,推測(cè)可能七氟醚處理濃度及干預(yù)時(shí)間不同,對(duì)MG的影響也不同所致。本研究還發(fā)現(xiàn),隨七氟醚濃度升高,細(xì)胞中NRF2、HO-1蛋白表達(dá)逐漸升高,HMGB1表達(dá)逐漸降低,預(yù)示七氟醚抑制缺氧誘導(dǎo)的MG活化及炎癥反應(yīng)作用,可能是通過(guò)促進(jìn)NRF2/HO-1活化,抑制HMGB1表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。為證明這一結(jié)論,本研究用SnPP抑制NRF2/HO-1通路后,發(fā)現(xiàn)SnPP組隨著NRF2及HO-1蛋白表達(dá)的降低,HMGB1促炎介質(zhì)表達(dá)顯著升高及NF-κB炎癥途徑活化的同時(shí),MG活化細(xì)胞比例及IL-1β釋放也進(jìn)一步高于缺氧誘導(dǎo)組,提示抑制NRF2/HO-1活化,可促進(jìn)HMGB1/NFκB介導(dǎo)的炎癥因子釋放,進(jìn)而促進(jìn)MG活化及炎癥反應(yīng)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),七氟醚對(duì)MG活化及炎癥反應(yīng)進(jìn)程的抑制作用可被SnPP逆轉(zhuǎn),表明七氟醚的上述作用與促進(jìn)NRF2/HO-1途徑活化,抑制HMGB1/NF-κB炎癥途徑活化有關(guān)。

綜上所述,七氟醚可通過(guò)促進(jìn)NRF2/HO-1途徑活化,抑制HMGB1/NF-κB炎癥途徑活化,減輕缺氧誘導(dǎo)的MG活化及炎癥反應(yīng)進(jìn)程,為闡明MG活化及炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制提供一定理論依據(jù)。但本研究還存在一定的不足,MG活化及炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制復(fù)雜,NRF2/HO-1/HMGB1可能只是其中的一條調(diào)控機(jī)制,對(duì)于其他可能的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。