長鏈非編碼RNA TUG1調控miR-137參與局灶性腦缺血大鼠神經損傷的作用機制

陳 俊,周赤忠,張 玲,喬 木?

(1.武漢市普仁醫院,武漢 430081;2.武漢科技大學醫學院,武漢 430081)

缺血性腦卒中發生率占腦卒中發生率的60%～80%,腦供血不足和氧氣缺乏均導致腦損傷[1]。腦供血不足、氧缺乏等造成腦功能受到影響、神經功能缺損等,具有高致殘率、致死率、復發率,已成為腦卒中死亡的主要原因之一[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)參與缺血性腦卒中神經元抗凋亡、抗炎等過程,為腦卒中的靶標治療提供依據[3]。牛磺酸上調基因1(taurine upregulated gene1,TUG1)是神經系統發育的重要調控因子,在氯胺酮誘導的神經元毒性中,干擾TUG1可降低海馬神經元凋亡和活性氧水平、并增加神經元存活能力,從而降低氯胺酮的神經毒性作用[4],但具體機制尚不清楚。微小RNA(microRNA,miRNA)作為重要的調節劑,miR-137充當神經元分化miRNA,在神經功能中發揮重要作用[5];在缺血性腦卒中中表達降低影響神經元凋亡[6],但與TUG1之間關系尚未發現研究。因此,Longa線栓法建立局灶性腦缺血大鼠模型,干擾TUG1探究其對神經元損傷的影響,初步探討TUG1影響缺血性腦卒中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

80只健康SD大鼠(北京維通利華實驗動物有限公司[SCXK(京)2017-0006]),SPF級、7～9周齡、雄性,體重(280±30)g。大鼠在溫度22℃、濕度50%左右條件下飼養。實驗動物在武漢華聯科生物技術有限公司[SYXK(鄂)2018-0104]單獨隔離暫養1周進行實驗。動物實驗研究經武漢市普仁醫院倫理委員會審批(2019L014),遵循3R原則。

1.1.2 細胞

大鼠海馬神經元購自基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心。

1.2 主要試劑與儀器

TUG1-MUT、TUG1-WT、miR-137mimic、miR-137NC、si-NC、si-TUG1、anti-miR-NC、anti-miR-137均購自廣州銳博生物科技有限公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、蛋白酪氨酸激酶1(januskinase 1,JAK1)、信號轉導子和轉錄激活子1(Signal transducer and activator of transcription1,STAT1)、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,BCL2)、BCL2相關X蛋白(BCL2associated X protein,BAX)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cystein-asparate protease3,caspase3)均購自英國abcam公司;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC)染 色 試 劑 盒、蘇 木 精-伊 紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒、尼氏染色試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。7500實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)儀購自美國ABI公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 雙熒光素酶驗證miR-137與TUG1的靶向關系

Starbase分析發現:miR-137與TUG1存在結合位點;將miR-137與TUG1結合處位點序列、結合處突變位點序列分別克隆重組至pGL3-basic熒光素酶報告載體上,構建TUG1野生型(TUG1-WT)及突變型(TUG1-MUT),分別與miR-137mimic或miR-137NC共轉染至海馬神經元中,檢測各組熒光素酶相對活性。

1.3.2 實驗分組及處理

參考文獻[7]采用Longa線栓法建立局灶性腦缺血大鼠模型,腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,大鼠仰臥固定在鼠板上,消毒頸部、備皮后縱向切開皮膚,暴露出頸外動脈(external carotid artery,ECA)、左側頸總動脈(common carotidartery,CCA),近心端縫合線結扎,動脈夾夾閉頸內動脈(internal carotidartery,ICA),距CCA分叉部4mm處剪一小口后,插一根直徑為0.24mm拴線,插向ICA,拴線尾端逐層縫合,2h后拔出栓線。Longa分級法對大鼠進行神經功能缺損評分,1～3分為制備成功的模型[8],成功60只,將其隨機分為模型組(model group)、si-NC組(si-NC group)、si-TUG1組(si-TUG1 group)、si-TUG1+anti-miR-NC組(si-TUG1+anti-miRNC group)、si-TUG1+anti-miR-137組(si-TUG1+antimiR-137group),每組12只。另12只大鼠假手術組(sham operation group),僅分離CCA、ECA、ICA。

si-NC組、si-TUG1組、si-TUG1+anti-miR-NC組、si-TUG1+anti-miR-137組各組分別在Bregma后3 mm、中線旁開2.2mm、深度2.5mm注射10μL si-NC、10μL si-TUG1、si-TUG1和anti-miR-NC各10 μL、si-TUG1和anti-miR-137各10μL,假手術組和模型組相同部位注射10μL生理鹽水。5d1次,第16天檢測下列指標。

1.3.3 樣本采集與處理

每組隨機選6只大鼠取全腦,TTC染色檢測腦梗死情況;剩余6只取腦組織中海馬區,部分4%多聚甲醛中固定,剩余-80℃冰箱保存。

1.3.4 RT-qPCR檢測海馬區TUG1、miR-137水平情況

-80℃冰箱組織,TRIzol法提取總RNA,逆轉錄成第一鏈cDNA。設計上下游引物序列,TUG1(F:5’-TACGTCCCGTGCCTCCTGAT-3’、R:5’-AGGGCT GTGCTGAATCTGGG-3’),miR-137(F:5’-GCGCGC TTATTGCTTAAGAATAC-3’、R:5’-GTGCAGGGTCC GAGGT-3’)。反應體系:2×Mix10μL,cDNA1μL,F/R(均為10μmol/L)各0.5μL,補ddH2O至20 μL。反應條件:94℃、60s;95℃、30s,(TUG1:59℃、40s,miR-137:59℃、35s),45個循環。2-ΔΔCt法計算TUG1、miR-137相對表達水平。

1.3.5 TTC染色檢測腦梗死情況

全腦置于-20℃冰箱冰凍15min后冠狀位切片,每個腦組織切片5片,腦片置于2% TTC中37℃恒溫水浴鍋中避光孵育30min,棄去TTC,置于4%多聚甲醛中4℃固定24h,拍照后用Image pro軟件進行分析處理,計算腦梗死體積。腦梗死體積=全腦梗死體積/全腦體積×100%。

1.3.6 HE染色觀察海馬神經元形態

多聚甲醛中固定的海馬組織切片(厚度:6 μm),蘇木精染色、乙醇鹽酸分色、伊紅復染,顯微鏡下觀察海馬區神經元形態。

1.3.7 尼氏染色觀察神經元形態

1.3.6中切片,二甲苯及梯度乙醇脫蠟、入預熱56℃的1%甲苯胺藍染色60min,經蒸餾水漂洗、95%乙醇分化、脫色數秒,顯微鏡下觀察神經元形態。

1.3.8 蛋白質免疫印跡(Western blot)實驗檢測海馬區JAK1、STAT1、BCL2、BAX、caspase3蛋白水平

-80℃取海馬組織后提取總蛋白。分離蛋白、轉膜后,5%脫脂奶粉室溫封閉2h;對應加入一抗JAK1、STAT1、BCL2、BAX、caspase3、GAPDH,4℃孵育過夜;加入二抗,室溫孵育2h;凝膠成像分析系統拍照后定量分析。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 雙熒光素酶鑒定miR-137與TUG1的靶向關系

miR-137與TUG1存在互補的結合位點,如圖1A。與miR-137NC+TUG1WT相比,miR-137mimic+TUG1WT熒光素酶相對活性下降(P＜0.05)。見圖1B。

圖1 雙熒光素酶鑒定miR-137與TUG1的靶向關系(±s,n=6)Figure1 Dual luciferase identification of the targeting relationship between miR-137and TUG1

2.2 各組海馬區TUG1、miR-137水平

與假手術組相比,模型組、si-NC組、si-TUG1+anti-miR-137組海馬區TUG1水平升高(P＜0.05),miR-137水平降低(P＜0.05);分別與模型組、si-NC組相比,si-TUG1組、si-TUG1+anti-miR-NC組海馬區TUG1水平降低(P＜0.05),miR-137水平升高(P＜0.05),si-TUG1+anti-miR-137組海馬區TUG1水平降低(P＜0.05);分別與si-TUG1組、si-TUG1+antimiR-NC組相比,si-TUG1+anti-miR-137組海馬區TUG1水平升高(P＜0.05),miR-137水平降低(P＜0.05)。見圖2A、2B。

圖2 海馬區TUG1、miR-137 水平(±s,n=6)Figure 2 TUG1 and miR-137 level in the hippocampus

2.3 各組腦梗死情況

與假手術組相比,模型組、si-NC組、si-TUG1組、si-TUG1+anti-miR-NC組si-TUG1+anti-miR-137組腦梗死體積升高(P＜0.05);分別與模型組、si-NC組相比,si-TUG1組、si-TUG1+anti-miR-NC組腦梗死體積下降(P＜0.05);分別與si-TUG1組、si-TUG1+anti-miR-NC組相比,si-TUG1+anti-miR-137組腦梗死體積升高(P＜0.05)。見圖3A、3B。

圖3 大鼠腦梗死體積(±s,n=6)Figure 3 Volume of cerebral infarction in rats

2.4 各組海馬區神經元HE染色情況

假手術組神經元未見異常,排列整齊、層次清晰,核膜、核仁清晰可見;模型組、si-NC組層次紊亂,神經元數量減少、間隙變大、部分出現神經元胞核固縮或溶解、核仁消失等現象;si-TUG1組、si-TUG1+anti-miR-NC組神經元數量有所增加、神經元形態有所恢復;si-TUG1+anti-miR-137組相較于si-TUG1組、si-TUG1+anti-miR-NC組神經元間隙變大、數量減少。見圖4。

圖4 大鼠海馬區神經元形態(HE 染色)Figure 4 Neuron morphology in the hippocampus of rats (HE staining)

2.5 各組海馬區神經元尼氏染色情況

假手術組神經元排列整齊且致密、神經元內尼氏體充盈;模型組、si-NC組神經元排列紊亂、間隙大,核膜、核仁模糊不清,尼氏體數量減少;si-TUG1組、si-TUG1+anti-miR-NC組神經元形態有所恢復,尼氏體數量增多;si-TUG1+anti-miR-137組相較于si-TUG1組、si-TUG1+anti-miR-NC組神經元形態破壞嚴重。見圖5。

圖5 大鼠海馬區神經元形態(尼氏染色)Figure 5 Neuronal morphology in the hippocampus of rats (Nissl staining)

2.6 各組海馬區JAK1、STAT1、BCL2、BAX、caspase3蛋白表達情況

與假手術組相比,模型組、si-NC組、si-TUG1+anti-miR-137組海馬區BCL2蛋白水平降低,JAK1、STAT1、BAX、caspase3蛋白水平升高(P＜0.05),si-TUG1組、si-TUG1+anti-miR-NC組海馬區JAK1、STAT1、caspase3蛋白水平升高(P＜0.05);分別與模型組、si-NC組相比,si-TUG1組、si-TUG1+anti-miRNC組海馬區BCL2蛋白水平升高,JAK1、STAT1、BAX、caspase3蛋白水平降低(P＜0.05),si-TUG1+anti-miR-137 組海馬區JAK1、STAT1、caspase3 蛋白水平降低(P＜0.05);分別與si-TUG1 組、si-TUG1+anti-miR-NC 組相比,si-TUG1+anti-miR-137 組海馬區BCL2 蛋 白 水 平 降 低, JAK1、 STAT1、 BAX、caspase3 蛋白水平升高(P＜0.05)。 見圖6A、6B、6C、6D。

圖6 海馬區JAK1、STAT1、BCL2、BAX、caspase3 蛋白表達情況(±s,n=6)Figure 6 JAK1, STAT1, BCL2, BAX and caspase3 protein expression in hippocampus

3 討論

缺血性腦卒中中腦組織血液動力學、能量代謝、離子均發生變化,導致細胞毒素積累,導致炎癥反應、細胞凋亡等,導致多種神經功能損傷,出現后遺癥包括語言障礙、肢體偏癱、認知功能障礙等,好發于中老年人,在青年人中發病呈上升趨勢[9-10]。本研究Longa 線栓法建立局灶性腦缺血大鼠模型,TTC 染色發現,腦組織腦梗死體積升高;HE 染色、尼氏染色檢測大鼠海馬區神經元發現,海馬區神經元排列紊亂、神經元數量減少、間隙變大、部分出現神經元胞核固縮或溶解、核仁消失明顯,提示局灶性腦缺血后大鼠海馬區神經元損傷明顯。

缺血性腦卒中為醫學上研究熱點,但目前尚無特效藥物治療[11]。 基因層面直到蛋白層面均參與缺血性腦卒中病理生理過程,且大部分基因轉錄為非編碼蛋白RNA,其中LncRNA 為長度超過200 nt的RNA 分子,在腦缺血后卒中發病機制、再灌注損傷等都具有重要作用,有望成為治療卒中的新靶點和思路[12]。 TUG1 作為首次在小鼠視網膜細胞中發現的LncRNA,在缺血性腦卒中中高表達,可以損傷細胞[13];TUG1 可通過靶向miR-221-3p/SPRED2 軸逆轉LPS 誘導的細胞凋亡和巨噬細胞炎癥,在細胞凋亡和炎癥反應中發揮作用[14];TUG1 過表達促進心肌細胞凋亡并預測心肌梗死的預后不良[15]。 本研究發現,與假手術組相比,模型組海馬區TUG1 水平升高,神經元損傷現象明顯,提示TUG1 在缺血性腦卒中中表達升高,可能促進神經元損傷從而影響疾病。 且TUG1 與miR-137 存在靶位點,本文干擾TUG1,在干擾TUG1 的基礎上抗miR-137,觀察抗miR-137 對TUG1 的影響。

miRNA 屬于非編碼RNA 中小非編碼RNA,長度為18～25 nt,廣泛存在于真核生物中,通過一系列過程轉化為成熟RNA,miRNA 具有高度保守性、時序性、組織特異性,具有作為生物標記物的潛在優勢[16]。 miR-137 在缺血性腦卒中表達下調,且BCL2 等作為miR-137 的靶基因,參與卒中后抑郁過程[17]。 BCL2、BAX、caspase3 作為影響細胞凋亡的基因,其中BCL2 作為抑制凋亡基因;BAX 具有促凋亡作用;caspase3 是細胞凋亡的關鍵執行因子,通過水解天冬氨酸殘基C 末端的肽鍵,激活下游caspase酶或分解細胞內相關底物蛋白,導致BCL2 等抗凋亡蛋白酶解、凋亡蛋白BAX 等細胞外基質和細胞骨架等的修復,促使細胞凋亡[18]。 本研究發現,與假手術組相比,模型組海馬區miR-137 水平降低;與模型組相比,si-TUG1 組海馬區miR-137 水平升高、腦梗死體積降低、神經元形態有所緩解,提示缺血性腦卒中干擾TUG1 后可以升高miR-137 的表達,緩解神經元狀態,實現對疾病的保護。 進一步驗證JAK1/STAT1 通路的作用發現,模型組JAK1/STAT1通路蛋白處于激活狀態,而miR-137 通過調節JAK1/STAT1 信號通路減輕大鼠局灶性腦缺血損傷[19];線粒體途徑細胞凋亡受JAK1/STAT1 信號通路的調控,活化的STAT1 可以調節凋亡途徑關鍵因子BCL2、BAX 的表達[20]。 激活后的STAT1 抑制BCL2 的表達、促進BAX 的表達從而促進神經元凋亡。 干擾TUG1 后JAK1、STAT1 蛋白表達水平降低,提示干擾TUG1 后促進miR-137 的表達從而抑制JAK1/STAT1 通路蛋白活化,使JAK1/STAT1 通路蛋白對BCL2、BAX 的作用降低,神經元凋亡得以緩解。 在si-TUG1 的基礎上抑制miR-137 表達可逆轉si-TUG1 的效果。

綜上所述,干擾TUG1 后可上調miR-137,從而緩解局灶性腦缺血大鼠神經元形態及凋亡,緩解神經損傷。 本研究首次驗證TUG1 與miR-137 在神經元中的關系,但LncRNA 與miRNA 之間關系復雜,亦可能通過別的miRNA 發揮作用,是本研究接下來研究重點。