LncRNA SNHG1對IL-6誘導(dǎo)的皮膚鱗狀細胞癌細胞的增殖和遷移的影響

鐘 咪,張佳音,饒美榮,曾 芬

(江南大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科,江蘇 無錫 214000)

皮膚鱗狀細胞癌又稱為皮膚鱗癌,是臨床皮膚科常見的、起源于皮膚表皮或附屬器細胞的惡性腫瘤,占所有皮膚癌癥的20%～50%,雖然大多數(shù)患者通過外科手術(shù)切除,但是還會出現(xiàn)一部分的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和死亡等現(xiàn)象[1-2]。皮膚鱗狀細胞癌發(fā)生轉(zhuǎn)移時先擴散至淋巴結(jié)群,然后進一步擴散至全身,嚴(yán)重威脅人類的生命安全,目前臨床上主要有外科手術(shù)、放射治療、免疫治療和化學(xué)治療等方法,但是仍會出現(xiàn)一些不良預(yù)后影響患者的治療效果[3-4]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)在多種人類癌癥中起著抑癌或促癌的功能,包括皮膚鱗狀細胞癌[5]。小核糖體管家基因RNA1(SNHG1)是從UHG轉(zhuǎn)錄而來的,位于11號染色體上,在多種癌癥異常表達,如結(jié)直腸癌、肝癌、肺癌和前列腺癌等,而SNHG1高表達與晚期的腫瘤分期、腫瘤大小、TNM分期和較短的總生存期密切相關(guān),可以介導(dǎo)參與多種癌癥細胞的增殖、遷移和侵襲等[6-7]。Liu等[8]研究結(jié)果顯示,SNHG1在宮頸癌組織和細胞中高表達,SNHG1 siRNA可以明顯降低宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。在大腸癌研究中結(jié)果顯示,SNHG1在大腸癌組織中高表達,與患者的總生存期有關(guān),敲低SNHG1可以明顯抑制大腸癌細胞的增殖[9],但在皮膚鱗狀細胞癌中的研究機制尚不明確。IL-6可從多種細胞(巨噬細胞、T細胞等)內(nèi)分泌而來,在免疫疾病和多種癌癥中更具有一定的作用效果[10]。因此,本研究通過IL-6處理A431細胞,旨在探討SNHG1對IL-6誘導(dǎo)皮膚鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT的作用及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞

正常皮膚細胞系HaCaT和皮膚鱗狀細胞癌細胞系A(chǔ)431、SCC13、SCL-1購自上海細胞研究所。

1.2 主要試劑與儀器

重組人IL-6(批號:041215-0J1017)購自美國PeproTech公司;胎牛血清(批號:JC40123)、DMEM培養(yǎng)基(AB10201724)購自美國Hyclone公司;TRIzol試劑盒(批號:CD203562GM)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號:43689132)、SYBR Green試劑盒(批號:RR536A)購自日本TaKaRa公司;LipofectamineTM3000試劑(批號:L3010015)購自美國Thermo Fisher公司;CCK-8試劑盒(批號:190210)購自上海全式金公司;Ki67抗體(批號:4023T)、MMP-2抗體(批號:1592T)、E-cadherin抗 體(批 號:3022T)、Ncadherin抗體(批號:3321T)、Vimentin抗體(批號:5637T)和GAPDH抗體(批號:2203T)購自美國CST公司;BCA試劑盒(批號P0037)、ECL試劑盒(批號P0072M)購自上海碧云天生物公司;Transwell小室(批號3369)購自美國Millipore公司;Matrigel基質(zhì)膠(批號356514)購自購自美國BD公司;si-NC、si-SNHG1和引物購自上海吉瑪公司。

C1000型聚合酶鏈反應(yīng)擴增儀購自美國Bio Rad公司;H1M全功能酶標(biāo)儀購自美國伯騰公司;BX51熒光顯微鏡購自日本Olympus公司;SDSPAGE電泳儀購自北京六一生物公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)和分組

取出冷凍保存的正常皮膚細胞系HaCaT和皮膚鱗狀細胞癌細胞系A(chǔ)431、SCC13、SCL-1,解凍后在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液內(nèi),然后在室溫下、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。觀察細胞生長狀態(tài),待細胞生長至85%時可進行消化傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的A431細胞,調(diào)整細胞濃度(1×105個/孔)鋪板在6孔板內(nèi),采取不同濃度的IL-6(0、0.5、5和50ng/mL)處理細胞,記為不同IL-6濃度組,其中0ng/mL記為對照組(Con),50 ng/mL記為IL-6組。將si-NC和si-SNHG1參照LipofectamineTM3000試劑盒說明書轉(zhuǎn)染至A431細胞內(nèi),然后采用50ng/mL的IL-6處理,記為IL-6+si-NC組和IL-6+si-SNHG1組。

1.3.2 qRT-PCR檢測SNHG1的表達

取對數(shù)生長期HaCaT、A431、SCC13、SCL-1細胞和各組A431細胞,參照TRIzol法提取細胞的總RNA,在紫外分光光度計下檢測RNA的純度和濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA模板,然后SYBR Green試劑配置PCR反應(yīng)體系進行PCR擴增。然后以18S rRNA為內(nèi)參,按照2-ΔΔCt方法計算SNHG1的 表達。SNHG1的正向引物為:5’-AGGCTGAAGTTACAGGT-3’,反 向 引 物 為:5’-TTGGCTCCCAGTGTCTT-3’;18S rRNA的正向引物為:5’-TACCACATCCAAGGAAGCA-3’,反向引物為:5’-TTTTCGTCACTACCTCCCCGG-3’。

1.3.3 CCK8檢測細胞活力

對數(shù)生長期的A431細胞,消化后調(diào)整細胞密度(4×103個/孔)鋪板在96孔板內(nèi),在室溫下、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48h,然后在每孔加入10μL的CCK-8試劑,1h后在酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測各組細胞的吸光度值(OD),細胞活力(%)=實驗組吸光度OD值/對照組吸光度OD值×100%。

1.3.4 Transwell法檢測細胞的遷移和侵襲

細胞遷移實驗:取各組對數(shù)生長期的A431細胞,用不含血清的DMEM培養(yǎng)液制備成細胞懸液,密度為每毫升5×104個,Transwell小室的上室加入200μL的細胞懸液,然后在Transwell小室的下室加入600μL的含有血清的DMEM培養(yǎng)液,在室溫下5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h,取出小室后擦去沒有遷移的細胞,采用4%甲醛固定及結(jié)晶紫染色,風(fēng)干后在選擇3個明亮視野于光學(xué)顯微鏡下觀察細胞遷移數(shù)目,其中觀察到的細胞即為遷移細胞數(shù)目。重復(fù)3次。

細胞侵襲實驗:在培養(yǎng)液內(nèi)按照比例稀釋Matrigel基質(zhì)膠,在Transwell小室的上室加入每孔40μL稀釋的Matrigel基質(zhì)膠,繼續(xù)培養(yǎng)5h后,后續(xù)實驗同上述遷移實驗。

1.3.5 Western blot檢測Ki67、MMP-2、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達

取對數(shù)生長期的A431細胞,在冰上裂解蛋白,30min后采取BCA試劑盒檢測定量總蛋白的濃度,取50μg的上樣蛋白進行凝膠電泳處理分離蛋白樣品,將分離的蛋白樣品轉(zhuǎn)膜,采用5%脫脂牛奶封閉,培養(yǎng)1h后加入一抗Ki67、MMP-2、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin,過夜孵育,加入二抗,2h后加入ECL電化學(xué)發(fā)光液,顯影,采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有試驗設(shè)置3次重復(fù),結(jié)果在SPSS22.0軟件中進行統(tǒng)計分析,計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,四組間比較采用單因素方差分析,采用SNK-q檢驗組間比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNHG1在皮膚鱗狀細胞癌細胞中的表達

與正常皮膚細胞系HaCaT相比,皮膚鱗狀細胞癌細胞系A(chǔ)431、SCC13、SCL-1中SNHG1的相對表達量明顯增加(P＜0.05),見表1。本研究通過選取差異較大的A431細胞進行后續(xù)實驗。

表1 SNHG1在皮膚鱗狀細胞癌細胞中的表達(±s,n=9)Table1 Expression of SNHG1in skin squamous cell carcinoma

表1 SNHG1在皮膚鱗狀細胞癌細胞中的表達(±s,n=9)Table1 Expression of SNHG1in skin squamous cell carcinoma

注:與HaCaT相比,?P＜0.05。Note.Compared with HaCaT,?P＜0.05.

分組Groups SNHG1 HaCaT 1.02±0.08 A431 2.33±0.21?SCC13 1.82±0.17?SCL-1 1.55±0.13?F 111.477 P 0.000

2.2 不同濃度IL-6誘導(dǎo)A431細胞后SNHG1表達

選取不同濃度(0、0.5、5和50ng/mL)的IL-6誘導(dǎo)A431細胞后,結(jié)果顯示,隨著IL-6濃度的增加,SNHG1相對表達量逐漸增加(P＜0.05)。見表2。

表2 不同濃度IL-6誘導(dǎo)A431細胞后SNHG1表達(±s,n=9)Table2 Expression of SNHG1in A431cells induced by different concentrations of IL-6

表2 不同濃度IL-6誘導(dǎo)A431細胞后SNHG1表達(±s,n=9)Table2 Expression of SNHG1in A431cells induced by different concentrations of IL-6

注:與0ng/mL相比,?P＜0.05。Note.Compared with0ng/mL,?P＜0.05.

IL-6濃度IL-6concentration SNHG1 0ng/mL 0.92±0.07 0.5ng/mL 1.27±0.11?5ng/mL 1.52±0.13?50ng/mL 2.11±0.18?F 136.416 P 0.000

2.3 不同濃度IL-6對A431細胞增殖、遷移和侵襲的影響

選取不同濃度(0、0.5、5和50ng/mL)的IL-6誘導(dǎo)A431細胞后,結(jié)果顯示,隨著IL-6濃度的增加,細胞活力、遷移細胞數(shù)目、侵襲細胞數(shù)目、Ki67和MMP-2蛋白表達逐漸增加(P＜0.05)。見圖1、表3。

圖1 不同濃度IL-6對A431細胞中Ki-67和Figure1 Effect of different concentrations of IL-6on Ki-67and

表3 不同濃度IL-6對A431細胞增殖、遷移和侵襲的影響(±s,n=9)Table3 Effects of different concentrations of IL-6on the proliferation,migration and invasion of A431cells

表3 不同濃度IL-6對A431細胞增殖、遷移和侵襲的影響(±s,n=9)Table3 Effects of different concentrations of IL-6on the proliferation,migration and invasion of A431cells

注:與0ng/mL相比,?P＜0.05。Note.Compared with0ng/mL,?P＜0.05.

IL-6濃度IL-6concentration細胞活力(%)Cell viability細胞遷移數(shù)目Number of cell migration細胞侵襲數(shù)目Number of cell invasion Ki67 MMP-2 0ng/mL 47.3±3.7 36.5±2.7 32.1±2.5 0.95±0.07 0.97±0.08 0.5ng/mL 61.5±5.3? 57.3±5.4? 51.4±3.7? 1.27±0.11? 1.39±0.14?5ng/mL 75.8±4.7? 93.1±7.2? 86.5±6.5? 1.61±0.17? 1.58±0.16?50ng/mL 88.3±6.2? 144.6±11.2? 138.7±10.8? 1.86±0.15? 1.76±0.17?F 110.660 377.256 440.757 82.996 51.354 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 不同濃度IL-6對A431細胞EMT的影響

選取不同濃度(0、0.5、5和50ng/mL)的IL-6誘導(dǎo)A431細胞后,結(jié)果顯示,隨著IL-6濃度的增加,E-cadherin蛋白表達逐漸降低(P＜0.05);而Ncadherin和Vimentin蛋白表達逐漸增加(P＜0.05)。見圖2、表4。

表4 不同濃度IL-6對A431細胞EMT的影響(±s,n=9)Table4 Effect of different concentrations of IL-6on EMT of A431cells

表4 不同濃度IL-6對A431細胞EMT的影響(±s,n=9)Table4 Effect of different concentrations of IL-6on EMT of A431cells

注:與0ng/mL相比,?P＜0.05。Note.Compared with0ng/mL,?P＜0.05.

IL-6濃度IL-6concentration E-cadherin N-cadherin Vimentin 0ng/mL 0.92±0.07 0.96±0.08 0.99±0.08 0.5ng/mL 0.74±0.05? 1.25±0.14? 1.31±0.15?5ng/mL 0.57±0.05? 1.59±0.17? 1.77±0.17?50ng/mL 0.36±0.03? 1.83±0.18? 1.92±0.19?F 190.528 60.052 69.709 P 0.000 0.000 0.000

圖2 不同濃度IL-6對A431細胞EMT的影響Figure2 Effect of different concentrations of IL-6on EMT of A431cells

2.5 干擾SNHG1對IL-6誘導(dǎo)A431細胞增殖、遷移和侵襲的影響

與Con組相比,IL-6組的SNHG1相對表達、細胞活力、遷移細胞數(shù)目、侵襲細胞數(shù)目、Ki-67和MMP-2蛋白表達明顯增加(P＜0.05);與IL-6+si-NC組相比,IL-6+si-SNHG1組的SNHG1相對表達、細胞活力、遷移細胞數(shù)目、侵襲細胞數(shù)目、Ki-67和MMP-2蛋白表達明顯降低(P＜0.05)。見圖3、表5。

表5 干擾SNHG1對IL-6誘導(dǎo)A431細胞增殖、遷移和侵襲的影響(±s,n=9)Table5 Effect of interference with SNHG1on the proliferation,migration and invasion of A431cells induced by IL-6

表5 干擾SNHG1對IL-6誘導(dǎo)A431細胞增殖、遷移和侵襲的影響(±s,n=9)Table5 Effect of interference with SNHG1on the proliferation,migration and invasion of A431cells induced by IL-6

注:與Con組相比,?P＜0.05;與IL-6+si-NC組相比,#P＜0.05。Note.Compared with con group,?P＜0.05.Compared with IL-6+si-NC group,#P＜0.05.

分組Groups SNHG1 細胞活力(%)Cell viability細胞遷移數(shù)目Number of cell migration細胞侵襲數(shù)目Number of cell invasion Ki-67 MMP-2 Con 1.02±0.08 48.4±5.3 42.3±3.4 35.3±2.7 0.99±0.07 0.98±0.08 IL-6 2.36±0.24? 82.5±6.7? 116.7±9.7? 104.3±9.8? 1.72±0.17? 1.71±0.16?IL-6+si-NC 2.32±0.21 83.9±7.1 110.4±10.5 97.8±7.5 1.70±0.16 1.68±0.17 IL-6+si-SNHG1 1.67±0.16# 66.8±5.2# 78.7±5.4# 65.4±5.2# 1.36±0.14# 1.42±0.13#F 107.890 65.861 171.221 195.775 53.095 52.793 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.001 0.001

圖3 干擾SNHG1對IL-6誘導(dǎo)A431細胞中Ki-67和MMP-2蛋白表達的影響Figure3 Effect of interference with SNHG1on IL-6-induced Ki-67and MMP-2protein expression in A431cells

2.6 干擾SNHG1對IL-6誘導(dǎo)A431細胞EMT的影響

與Con組相比,IL-6組的E-cadherin蛋白表達明顯降低(P＜0.05);而N-cadherin和Vimentin蛋白表達明顯增加(P＜0.05);與IL-6+si-NC組相比,IL-6+si-SNHG1組的E-cadherin蛋白表達明顯增加(P＜0.05);而N-cadherin和Vimentin蛋白表達明顯降低(P＜0.05)。見圖4、表6。

表6 干擾SNHG1對IL-6誘導(dǎo)A431細胞EMT的影響(±s,n=9)Table6 Effect of interfering with SNHG1on IL-6-induced EMT in A431cells

表6 干擾SNHG1對IL-6誘導(dǎo)A431細胞EMT的影響(±s,n=9)Table6 Effect of interfering with SNHG1on IL-6-induced EMT in A431cells

注:與Con組相比,?P＜0.05;與IL-6+si-NC組相比,#P＜0.05。Note.Compared with con group,?P＜0.05.Compared with IL-6+si-NC group,#P＜0.05.

分組Groups E-cadherin N-cadherin Vimentin Con 0.95±0.08 1.02±0.07 1.01±0.08 IL-6 0.43±0.04? 1.87±0.18? 1.87±0.17?IL-6+si-NC 0.45±0.05 1.85±0.17 1.89±0.18 IL-6+si-SNHG1 0.71±0.06# 1.42±0.15# 1.38±0.14#F 154.128 66.264 73.935 P 0.000 0.000 0.000

圖4 干擾SNHG1對IL-6誘導(dǎo)A431細胞EMT的影響Figure4 Effect of interference with SNHG1on IL-6-induced EMT in A431cells

3 討論

IL-6細胞因子家族成員眾多,主要由IL-6、IL-11、IL-27、IL-31、OSM、LIF、CNTF、CT-1和CLCF1組成,IL-6可以激活下游的細胞內(nèi)的信號通路參與腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT等生物學(xué)過程[11-12]。徐書方等[13]研究結(jié)果顯示,IL-6處理宮頸癌細胞后,miR-152可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路抑制IL-6誘導(dǎo)宮頸癌細胞的增殖和侵襲。向飛等[14]研究結(jié)果顯示,采用不同濃度的IL-6誘導(dǎo)食管癌細胞后,IL-6呈劑量依賴性抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲,并下調(diào)SOCS3、MMP-2和MMP-9蛋白表達,過表達的SOCS3可以抑制IL-6誘導(dǎo)的增殖、遷移和侵襲,這與本研究結(jié)果相似。邵揚謙等[15]研究結(jié)果顯示,IL-6呈劑量和時間依賴性促進甲狀腺癌細胞的lnc TCF7表達,選擇50μg/L的IL-6處理甲狀腺癌細胞后,明顯促進甲狀腺癌細胞的遷移和侵襲,下調(diào)E-cadherin蛋白表達,上調(diào)Vimentin、Snail和Slug蛋白表達,敲減lnc TCF7可以減緩IL-6誘導(dǎo)的甲狀腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT。IL-6、IL-1β、IL-17A和OSM等在皮膚鱗狀細胞癌組織高表達,其中OSM差異較大,與1型免疫極化有關(guān),可以促進正常角質(zhì)形成細胞的增殖、遷移[16]。本研究結(jié)果顯示,我們通過采取不同濃度的IL-6處理A431細胞后結(jié)果顯示,IL-6呈劑量依賴性誘導(dǎo)細胞活性、遷移細胞數(shù)目和侵襲細胞數(shù)目,以及上調(diào)Ki67、MMP-2、N-cadherin和Vimentin蛋白表達,下調(diào)E-cadherin蛋白表達。Ecadherin、N-cadherin和Vimentin是EMT的標(biāo)記蛋白,在癌癥發(fā)展過程中,上皮腫瘤細胞可能會進行EMT,導(dǎo)致細胞在形態(tài)和功能上發(fā)生改變,導(dǎo)致上皮標(biāo)志物E-cadherin的丟失,導(dǎo)致細胞極性改變,促進間充質(zhì)蛋白N-cadherin和Vimentin的表達[17]。上述結(jié)果顯示,IL-6可以促進A431細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT。

越來越多的結(jié)果顯示,LncRNA可以作為皮膚鱗狀細胞癌的生物標(biāo)志物,如LINC00319在皮膚鱗狀細胞癌組織和細胞中高表達,通過χ2測試發(fā)現(xiàn)LINC00319高表達與腫瘤大小、晚期TNM分期和淋巴管浸潤密切相關(guān),LINC00319通過上調(diào)miR-1207-5p抑制皮膚鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲,并促進細胞凋亡,阻滯細胞周期[18]。LINC00162(PICSAR)在皮膚鱗狀細胞癌細胞中高表達,抑制LINC00162可以明顯抑制皮膚鱗狀細胞癌細胞的增殖和遷移[19]。Mei等[20]研究結(jié)果顯示,通過微陣列分析篩選皮膚鱗狀細胞癌樣品中差異表達的lncRNA,結(jié)果發(fā)現(xiàn),LINC00520低表達,LINC00520通過靶向EGFR激活PI3K/AKT信號通路抑制皮膚鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲,這與本研究結(jié)果不一致。李珊珊等[21]通過qRT-PCR和原位雜交檢測MALAT1的表達,結(jié)果顯示,MALAT1在皮膚鱗癌組織中高表達,下調(diào)MALAT1可以明顯抑制皮膚鱗癌細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT。SNHG1在多種癌癥中異常表達,如SNHG1在胃癌組織中高表達,與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較低的總生存率密切相關(guān),干擾SNHG1可以明顯抑制胃癌細胞的增殖[22],這說明SNHG1可以作為癌癥的潛在生物標(biāo)記物。本研究結(jié)果顯示,SNHG1在皮膚鱗狀細胞癌細胞中高表達,采用不同濃度的IL-6處理A431細胞后,IL-6呈劑量依賴性誘導(dǎo)SNHG1的表達,進一步實驗結(jié)果顯示,干擾SNHG1可以部分回復(fù)IL-6誘導(dǎo)的A431細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT的作用,這說明SNHG1可以參與IL-6誘導(dǎo)的皮膚鱗狀細胞癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

綜上所述,IL-6誘導(dǎo)皮膚鱗狀細胞癌細胞中SNHG1表達上調(diào),干擾SNHG1可以減緩IL-6誘導(dǎo)的增殖、遷移、侵襲和EMT,為皮膚鱗狀細胞癌提供新的診斷標(biāo)志物。