銀杏蜜環(huán)口服溶液對大鼠心肌微血管內皮細胞血管新生能力的影響

韓 笑,姚明江,任建勛,付建華,任鈞國,金 龍,郭 浩,趙步長,王益民,劉建勛?

(1.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院基礎醫(yī)學研究所,北京市中藥藥理重點實驗室,北京 100091;2.西安步長中醫(yī)心腦病醫(yī)院,西安 710082)

血管新生在胚胎發(fā)育、組織修復、心室重構、腫瘤等生理病理過程中具有重要作用。近年來缺血性血管疾病的防治從單純改變病變血管供血,轉向如何促進側支循環(huán)的建立,因而促血管新生成為缺血性血管疾病的治療新方向[1]。心肌微血管內皮細胞是心肌與血液交換能量的主要屏障,可合成多種細胞因子和活性物質,維持正常心肌的功能,參與心肌缺血后血管新生[2]。很多中藥可以促進血管新生、促進側支循環(huán),在治療缺血性心腦血管疾病方面具有良好的應用前景[3]。

銀杏蜜環(huán)口服溶液主要由銀杏葉提取物和天麻蜜環(huán)菌組成,銀杏葉提取物有活血化瘀通絡之功,蜜環(huán)菌可鎮(zhèn)靜安神,臨床用于治療冠心病、心絞痛、缺血性腦血管疾病,可改善心腦缺血性癥狀[4-5]。藥理研究顯示,銀杏蜜環(huán)口服溶液可保護急性心肌缺血大鼠[6]和犬[7],減輕腦缺血再灌注大鼠腦梗死[8],對缺氧復氧損傷臍靜脈內皮細胞[9]、腦微血管內皮細胞損傷[10]具有保護作用,但是對血管新生方面的研究尚未見報道。本研究旨在觀察銀杏蜜環(huán)口服溶液對大鼠心肌微血管內皮細胞血管新生能力的影響,發(fā)掘銀杏蜜環(huán)口服溶液治療缺血性心血管疾病的藥效機制。

1 材料和方法

1.1 細胞

大鼠心肌微血管內皮細胞CMECs(Cat NO.C645,ATCC)。

1.2 主要試劑與儀器

銀杏蜜環(huán)口服溶液(每10mL含30mg銀杏葉提取物和1000mg蜜環(huán)菌粉,邛崍?zhí)煦y制藥有限公司提供,批號190721);DMEM培養(yǎng)基(GIBCO,8119352);胎牛血清(Biowest,S14735S1820);胰蛋白酶消化液(Solarbio,T1300);青霉素-鏈霉素SP(Gibco,1894156);CCK-8試劑盒(Dojindo,CK04);Matrigel基質膠(Corning,356237);RIPA細胞裂解液(Solarbio,R0010);BCA蛋白濃度測定試劑盒(Solarbio,20191229);5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(KeyGEN BioTECH,20160712);10×電泳緩沖液、10×電轉移緩沖液、10×封閉洗滌液、封閉專用脫脂奶粉(北京普利來基因技術有限公司);化學發(fā)光檢測試劑盒(Thermo Scientific,UI291092);VEGF抗體(Abcam,A3098);CD31抗體(Abcam,ab24590);βactin抗體(Proteintech,66009-1);辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(YUABIO,127760);辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG抗體(YUABIO,203700113)。

活細胞工作站(Olympus,IX81);酶標儀(BioTek SYNERGY4);電 泳 儀(BIO-RAD,Power Pac Univeral);凝膠成像儀(BIO-RAD,ChemiDocTMXRS+)。

1.3 實驗方法

1.3.1 CMECs細胞培養(yǎng)

CMECs細胞以DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%FBS和1%青/鏈霉素)培養(yǎng),細胞生長至80%融合時,胰蛋白酶消化液消化傳代,取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3.2 分組及給藥

分組:對照組、銀杏蜜環(huán)口服溶液高劑量組(2.6mg/mL,簡稱銀蜜高)、中劑量組(1.3mg/mL,簡稱銀蜜中)、低劑量組(0.6mg/mL,簡稱銀蜜低)。對照組用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng);銀蜜高、中、低組適時(給藥時間因實驗不同而不同,具體見下)吸棄舊培養(yǎng)基,加入含藥DMEM培養(yǎng)基。

1.3.3 CMECs增殖檢測

細胞增殖實驗用CCK-8法。細胞以1×105/mL的密度接種于96孔板,待細胞充分貼壁后,棄舊培養(yǎng)基,對照組換成DMEM培養(yǎng)基(每孔100μL),銀蜜高、中、低劑量組分別換成含銀蜜2.6、1.3、0.6 mg/mL的DMEM培養(yǎng)基(每孔100μL),將細胞放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。24h后取出加入CCK-8溶液每孔10μL,孵育3h,酶標儀測定450nm處的吸光度OD值,OD值大小與活細胞的數量成正比。細胞增殖率(%)=(給藥組OD值-對照組OD值)/對照組OD值×100%

1.3.4 CMECs遷移檢測

細胞遷移率借助細胞劃痕法,比較各組細胞劃痕面積愈合百分比(%),評價銀杏蜜環(huán)口服液對CMECs遷移能力的影響。CMECs以每孔5×105cells的密度接種于6孔板內,待形成完全融合的單層細胞層后,用200μL無菌槍頭在孔中畫“井”字型劃痕無菌PBS洗細胞3次,去除劃下的脫落細胞碎片,確保劃線后留下的間隙清晰可見。此時,對照組加入DMEM培養(yǎng)基,銀蜜高、中、低劑量組分別換成含銀蜜2.6、1.3、0.6mg/mL的DMEM培養(yǎng)基,放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)。于劃痕后即刻(0h)、劃痕后6h、劃痕后24h顯微鏡觀察橫豎劃痕交叉點四周的固定檢測點,拍照,Image J軟件計算劃痕面積。細胞遷移率(%)=(原劃痕面積-殘留面積)/原劃痕面積×100%。

1.3.5 CMECs體外成管實驗

將Matrigel基質膠、24孔板、槍頭提前預冷。向預冷的24孔板中加入Matrigel基質膠(每孔250 μL),放入培養(yǎng)箱30min固化成膠。將CMECs接種于Matrigel基質膠包被好的24孔板中,放回培養(yǎng)箱待細胞貼壁后,對照組換成DMEM培養(yǎng)液,銀蜜高、中、低劑量組分別換成含銀蜜2.6、1.3、0.6mg/mL的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3h。3h后倒置顯微鏡下觀察細胞成管情況,每孔隨機選取5個視野拍照。Image J圖像分析軟件分析,以網眼數、網眼面積、交叉點數表示各組CMECs的成管能力。網眼和交叉點示意圖見圖1。

圖1 體外成管實驗主要檢測指標示意圖Figure1 Schematic diagram of main detection indexes in vitro tube forming experiment

1.3.6 CMECs CD31、VEGF蛋白免疫印跡檢測

CMECs經藥物處理后預冷的RIPA裂解液冰上超聲裂解細胞,13000r/min,4℃離心后取上清測蛋白濃度。取等量蛋白上樣,SDS-PAGE分離后,將蛋白轉印至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫搖床封閉1h,CD31、VEGF一抗(1∶1000),4℃冰箱孵育過夜。TBST洗膜3次,辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶20000)室溫孵育2h,TBST洗滌3次后,增強型化學發(fā)光試劑(ECL)顯色,Image Lab3.0系統(tǒng)成像軟件采集凝膠成像圖片,分析條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 銀杏蜜環(huán)口服溶液對CMECs增殖的影響

與對照組相比,銀蜜高、中、低劑量可顯著促進CMECs增殖,具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05～0.001);銀蜜高促進細胞增殖生長的作用優(yōu)于銀蜜中、低組(P＜0.001);銀蜜中劑量與低劑量組相比,未見統(tǒng)計學差異。結果提示銀杏蜜環(huán)口服溶液對CMECs具有顯著的增殖效應,見表1。

表1 銀杏蜜環(huán)口服溶液對CMECs增殖的影響(±s,n=6)Table1 Effect of YM(Yinxing Mihuan oral solution)on proliferation of CMECs

表1 銀杏蜜環(huán)口服溶液對CMECs增殖的影響(±s,n=6)Table1 Effect of YM(Yinxing Mihuan oral solution)on proliferation of CMECs

注:與對照組比較,?P＜0.05,???P＜0.001;與銀蜜中組比較,△△△P＜0.001;與銀蜜低組比較,▲▲▲P＜0.001。Note.Compared with control group,?P＜0.05,???P＜0.001.Compared with YM medium dose group,△△△P＜0.001.Compared with YM low dose group,▲▲▲P＜0.001.

組別Groups劑量Dose增殖率(%)Proliferation rate對照組Control group / 0±0銀蜜高組YM high dose group2.6mg/mL 34.0±4.9???△△△▲▲▲銀蜜中組YM medium dose group1.3mg/mL 10.5±5.2?銀蜜低組YM low dose group 0.6mg/mL 8.6±4.5?

2.2 銀杏蜜環(huán)口服溶液對CMECs遷移的影響

結果顯示,6h時間點,銀蜜高組細胞遷移率顯著高于對照組,具有統(tǒng)計學差異(P＜0.001),銀蜜中、低組CMECs遷移率大于對照組,但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);在24h時間點,銀蜜高、中、低組細胞遷移率明顯高于對照組,具有統(tǒng)計學差異(P＜0.001),且銀蜜高組遷移率顯著高于銀蜜中、低組(P＜0.001);銀蜜中組遷移率高于銀蜜低組(P＜0.001)。提示銀蜜可促進CMECs遷移,且促進CMECs遷移的能力隨著銀蜜劑量的增加而增強、隨時藥物作用時間的延長而增加。見表2,圖2。

表2 銀杏蜜環(huán)口服溶液對CMECs遷移率(%)的影響(±s,n=6)Table2 Effect of YM on CMECs mobility rate

表2 銀杏蜜環(huán)口服溶液對CMECs遷移率(%)的影響(±s,n=6)Table2 Effect of YM on CMECs mobility rate

注:與對照組比較,???P＜0.001;與銀蜜中組比較,△△△P＜0.001;與銀蜜低劑量組比較,▲▲▲P＜0.001。Note.Compared with control group,???P＜0.001.Compared with YM medium dose group,△△△P＜0.001.Compared with YM low dose group,▲▲▲P＜0.001.

組別Groups劑量Dose 6h遷移率(%)6h mobility rate 24h遷移率(%)24h mobility rate對照組Control group / 6.5±5.7 22.1±6.0銀蜜高組YM high dose group 2.6mg/mL 15.1±3.3??? 57.7±5.5???△△△▲▲▲銀蜜中組YM medium dose group 1.3mg/mL 13.0±8.8 44.9±5.6???▲▲▲銀蜜低組YM low dose group 0.6mg/mL 11.7±4.7 31.4±2.9???

圖2 銀杏蜜環(huán)口服溶液對CMECs遷移能力的影響Figure2 Effect of YM on migration ability of CMECs

2.3 銀杏蜜環(huán)口服溶液對CMECs成管的影響

CMECs細胞接種于Matrigel基質膠孔中后,剛開始呈圓形或卵圓形,30min后基本貼壁,1h后細胞逐漸伸展并伸出突起,3h后突起相互連接形成小管樣結構。銀蜜有良好的促進CMECs成管作用,且促CMECs成管的能力隨藥物劑量的增加而增強,見圖3、表3。

表3 銀杏蜜環(huán)口服溶液對CMECs網眼數、網眼面積、交叉點數的影響(±s,n=3)Table3 Effect of YM on meshes number,meshes area and junctions of CMECs

表3 銀杏蜜環(huán)口服溶液對CMECs網眼數、網眼面積、交叉點數的影響(±s,n=3)Table3 Effect of YM on meshes number,meshes area and junctions of CMECs

注:與對照組比較,?P＜0.05,??P＜0.01,???P＜0.001;與銀蜜中組比較,△△△P＜0.001;與銀蜜小組比較,▲P＜0.05,▲▲▲P＜0.001。Note.Compared with control group,?P＜0.05,??P＜0.01,???P＜0.001.Compared with YM medium dose group,△△△P＜0.001.Compared with YM low dose group,▲P＜0.05,▲▲▲P＜0.001.

組別Groups劑量Dose網眼數(個)Nb meshes(NO.)網眼面積(像素)Meshes area(PX)交叉點數(個)Nb junctions(NO.)對照組Control group / 2±2 9585±8034 30±11銀蜜高YM high dose group 2.6mg/mL 10±6??▲ 112307±96316??▲ 60±16???△△△▲▲銀蜜中YM medium dose group 1.3mg/mL 5±3? 35283±28857? 41±12?銀蜜低YM low dose group 0.6mg/mL 4±3 22072±13128? 39±14

圖3 銀杏蜜環(huán)口服溶液對CMECs小管形成的影響Figure3 Effect of YM on tubule formation of CMECs

網眼數及網眼面積結果顯示,與對照組相比銀蜜高、銀蜜中組網眼數顯著增多(P＜0.01,P＜0.05)、網眼面積更大(P＜0.01,P＜0.05),其中銀蜜高組網眼的數量及面積與銀蜜低組相比具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。銀蜜低組網眼數量增多,但與對照組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05),網眼面積顯著大于對照組(P＜0.05)。交叉點數結果顯示:銀蜜高組細胞網狀結構的交叉點顯著多于對照組、銀蜜中、低劑量組(P＜0.001);銀蜜中、低組交叉點數高于對照組,銀蜜中組與對照組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。

2.4 銀杏蜜環(huán)菌口服溶液對CMECs CD31、VEGF蛋白表達的影響

結果顯示,與對照組相比,銀蜜高、銀蜜中組CD31、VEGF蛋白表達量均顯著升高(P＜0.05～0.001),銀蜜低組CD31和VEGF表達有升高趨勢,但統(tǒng)計學意義(P＞0.05);銀蜜高組CD31、VEGF表達量顯著高于銀蜜中、低組(P＜0.001),見圖4。

圖4 銀杏蜜環(huán)口服溶液對CMECs CD31、VEGF表達的影響Figure4 Effect of YM on the expression of CD31、VEGF in CMECs

3 討論

冠心病的死亡率呈逐年上升態(tài)勢,建立有效的冠狀動脈側支循環(huán)可以在一定程度上緩解心肌缺血癥狀,降低患者的病死率[11-12],而側支循環(huán)的形成有賴于新生血管,血管新生能力是側支循環(huán)建立的基礎和關鍵[13]。治療性血管新生成為缺血性心臟病治療的新途徑[14]。

銀杏蜜環(huán)口服溶液主要有效物質為銀杏葉提取物和天麻蜜環(huán)菌,其有銀杏葉具有活血、化瘀、通絡之功效,銀杏葉提取物具有保護線粒體、抑制細胞凋亡、抗氧化、抗炎、擴張血管、改善血液循環(huán)的作用[15];天麻蜜環(huán)菌與天麻共生,與天麻有相似的藥理作用和臨床療效[16],具有抗炎、抑制細胞凋亡、抑制血小板活化、抗血栓等藥效[17],與化瘀通絡功效相似。銀杏蜜環(huán)口服溶液臨床用于治療缺血性心血管疾病,但機制是否與促進心肌缺血區(qū)血管新生的作用少見報道。

血管生成是一個復雜過程,涉及激活期血管基底膜降解;血管內皮細胞的激活、增殖、遷移;重建形成新的血管和血管網等環(huán)節(jié)[18]。血管生成受機體多種因素如CD31和VEGF的調節(jié)。CD31又稱為血小板-內皮細胞粘附分子,存在于血管內皮細胞緊密連接處,CD31胞內結構域的酪氨酸殘基磷酸化,啟動絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調節(jié)蛋白激酶信號通路,調控細胞的增殖、分化、遷移和凋亡,促進血管生成[19]。VEGF是血管內皮細胞的特異性有絲分裂劑,促進血管內皮細胞的增殖和遷移,抑制內皮細胞凋亡,增加血管的滲透性[20-21],使血漿蛋白溢出凝結形成凝膠體,成為血管生成的臨時基質,為內皮細胞遷移提供纖維網絡,在促血管生成的調控中發(fā)揮重要作用[22-25]。

本研究觀察銀杏蜜環(huán)口服溶液對體外培養(yǎng)CMECs增殖、遷移及血管樣管腔形成的影響;同時檢測與血管生成密切相關的CD31、VEGF蛋白表達情況,綜合評價銀杏蜜環(huán)口服溶液體外促血管新生的能力及機制。實驗結果提示,銀蜜高、中、低劑量具有顯著促進CMECs增殖、遷移和成管的藥效,且藥效隨著銀蜜實驗劑量的增加而增強。同時,銀蜜還可明顯上調CD31和VEGF的蛋白表達,銀蜜劑量越高,內皮細胞CD31和VEGF的蛋白表達量越高。

依據上述細胞學研究結果,可以推測銀蜜促進細胞增殖的作用將為血管生成提供足夠多的細胞、促進細胞遷移的能力則把增殖的內皮細胞遷移至需要生成血管的部位,為血管生成提供物質基礎,之后銀蜜促成管的作用將幫助機體利用輸送過來的增殖細胞,組建管樣網狀結構。同時,銀蜜刺激內皮細胞CD31和VEGF的表達,二者協(xié)同內皮細胞增殖、遷移、成管過程,并為血管網的生成提供臨時基質和纖維網絡,最終形成管腔樣結構。

在Matrigel基質膠成管實驗中,銀蜜高劑量組網眼數量、網眼面積、交叉點數量都顯著高于對照組、銀蜜中、銀蜜低劑量組。網眼數量越多,網眼面積越大,代表可能形成血管管腔越多,血管管徑可能越粗,大口徑的新生血管將有可能為缺血組織提供更多的血供,更為有效地發(fā)揮缺血代償作用。交叉點越多,血管網狀結構就越牢固越成熟。可見,銀蜜高劑量顯示出更好的促進CMECs體外成管的藥效。

綜上所述,銀杏蜜環(huán)口服溶液可促CMECs增殖、遷移、成管,并能上調細胞CD31和VEGF的表達,具有良好的體外促血管新生的能力,其活血、化瘀、通絡的功效及其治療缺血性心臟病的藥效機制與其促血管新生的作用具有一定相關性。促血管生成更深入的機制將在細胞及心肌缺血動物模型上進行。