尿酸性腎病大鼠模型建立的研究

嚴美霞,霍 帥,田瑞敏,5,徐 鵬,5,黎 創,5,胡天祥,陳達豪,陳小玲,毛 煒,6?

(1.省部共建中醫濕證國家重點實驗室(廣州中醫藥大學第二附屬醫院),廣州 510120;2.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院,廣州 510120;3.廣東省中醫院腎內科,廣州 510120;4.河南省人民醫院腎內科,華中阜外醫院腎內科,鄭州 450003;5.廣東省中醫藥防治難治性慢病重點實驗室,廣州 510006;6.廣東省中醫證候臨床研究重點實驗室,廣州 510006)

高尿酸血癥(hyperuricemia,HUA)為體內嘌呤代謝紊亂和(或)腎對尿酸排泄障礙所致的一種常見代謝性疾病。尿酸性腎病(uric acid nephropathy,UAN)是HUA最常見的并發癥之一[1-2],尿酸鹽結晶在腎小管的沉積為其主要病因。大鼠是最常用的實驗研究動物之一,但因大鼠體內的UA在尿酸酶作用下可分解成尿囊素,難以出現自發性HUA及UAN,目前國內多采用氧嗪酸鉀灌胃或腹腔注射,聯合腺嘌呤或酵母灌胃等方法[3]。在氧嗪酸鉀作用下,大鼠體內尿酸酶活性下降,抑制UA分解,導致血UA增多,單用氧嗪酸類藥物在短期內(5周)可引起大鼠腎動脈病變,需要干預7周以上才能出現明顯的腎損傷[4]。該造模方法可引起輕度腎損傷,而造模時間長,氧嗪酸鉀藥物價格偏貴,若想探究腎小管間質纖維化,則成模周期更長。而尿酸作為引起UAN的直接物質,不用經過體內嘌呤代謝過程。有研究將氧嗪酸鉀注射聯合尿酸灌胃,第5～6周先后出現腎的炎癥反應、腎動脈病變及高血壓等病變[5],本研究嘗試采用混合氧嗪酸鉀和不同濃度尿酸灌胃的方法,嘗試建立一種操作簡便、重復性好、能夠穩定模擬人類尿酸性腎損害的的UAN大鼠模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠,SFP級,20只,體重180～220g,購于廣東省醫學實驗動物中心[SCXK(粵)2016-0041]。無菌手術在廣東省中醫藥科學院動物實驗室屏障動物實驗設施進行[SYXK(粵)2018-0094],本實驗經由廣東省中醫藥科學院動物倫理委員會批準(2017044),同時,向實驗動物給予3R原則的人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

氧嗪酸鉀(批號:STBH0976)、尿酸(批號:BCCBB2049)購自Sigma公司;羧甲基纖維素鈉(批號:20090328)購自上海阿拉丁公司;PBS粉包(批號:14E05A30)購自武漢博士德公司;10%福爾馬林固定液(批號:JX0100)購自廣州晶欣生物公司;二甲 苯(批 號:20201003)、無 水 乙 醇(批 號:20200820)、3%過氧化氫溶液(批號:20160304)購自天津大茂化學試劑廠;蘇木素伊紅染液(批號:092520201211)購自上海碧云天公司;中性樹膠(批號:20130917)購自上海國藥集團化學試劑公司;CD68(批號:GR3287728-2)、E-cadherin(批號:GR3260950-7)、α-SMA(批號:GR248336)購自美國abcam公司。羅氏自動生化分析儀(C702)購自德國Roche公司;組織包埋機(Histostar)購自Thermo Fisher公司;電動顯微鏡成像系統(BX61)購自日本OLYMPUS公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

動物于廣東省中醫藥科學院實驗動物中心SPF級動物房分籠適應性飼養7d后,將已編號的大鼠升序排列體重值,同時經由隨機數字表完成分組設計,隨機劃分出4組,每組5只,即正常組(Control組)、模型A組(M-A組)、模型B組(M-B組)、模型C組(M-C組),其中A、B、C組分別給予氧嗪酸鉀750mg/kg+尿酸150mg/kg、氧嗪酸鉀750mg/kg+尿酸300mg/kg、氧嗪酸鉀750mg/kg+尿酸600mg/kg[6],正常組所用為相應量的0.3%羧甲基纖維素鈉溶液,灌胃頻次為每天1次,每3d對大鼠體重進行稱定,同時基于體重對灌胃劑量進行調節,連續灌胃4周[6]。

1.3.2 標本留取

灌胃4周后收取大鼠血液樣本,再借助低速臺式離心機,于轉速為3000r/min時實施15min離心操作,將分離出的血清分裝至無菌的1.5mL離心管中,凍存于-80℃冰箱中。造模4周后取1/2右腎放置4%的多聚甲醛固定液中。

1.3.3 生化指標檢測

借助羅氏自動生化分析儀與配套檢測試劑,對大鼠血清檢測以下指標:血尿酸(serum uric acid,sUA)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(serum creatinine,sCr)、甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein,LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein,HDL-C)[6]。

1.3.4 病理檢測及分析

將腎組織移至4%的多聚甲醛溶液內,固定24 h,再實施常規石蠟包埋操作,之后切片厚度為3 μm,實施蘇木素-伊紅(HE)染色;Masson染色;免疫組化檢測CD68、E-Cadherin、α-SMA的表達。并利用顯微鏡觀察大鼠腎組織形態學變化,拍照記錄,然后讀片。

(1)HE染色:按照5分制評分法進行評分[7],評估細則根據腎病理損傷程度以病理損傷面積與拍攝視野面積比值(%)的大小判斷:腎小球系膜基質是否增寬、增厚;腎小球硬化與否;腎小管萎縮與否;炎癥細胞是否浸潤腎間質;腎組織是否存在纖維化,具體為:無損傷為0分,小于10%為1分,10%～25%為2分,25%～50%為3分,50%～75%為4分,大于75%為5分,病理分析由兩人獨立進行。各組隨機確定3個樣本,各樣本隨機確定8個視野參與評分。

(2)Masson染色:首先進行石蠟切片,再行Masson染色,顯微鏡下記錄其形態學改變,Masson染色膠原呈藍色,每組3個樣本,于400倍顯微鏡下隨機選取8個視野,借助圖像分析軟件Image J開展分析,其中視野總范圍中膠原陽性藍染部分的占比即膠原容積分數(collagen volume fraction,CVF),將其平均值定為該組織CVF。

(3)免疫組化:4%多聚甲醇固定腎組織制成3 μm厚的石蠟切片脫蠟后,高壓處理修復抗原,3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶,加一抗CD68、ECadherin、α-SMA,4℃孵育過夜之后,第2天進行二抗孵育,DAB顯色,蘇木素復染,最后常規脫水、封片。采用Image J軟件評估免疫組化目的蛋白含量,目的蛋白的表達量即為陽性染色區域(棕色染色區域)與拍攝視野的百分比(%),各組隨機確定3個樣本,各切片隨機確定8個視野參與評分,同時計算。

1.4 統計學方法

所有數據均為計量資料,首先評估其呈正態分布與否,符合者以平均數±標準差(±s)的形式表示,若非正態分布,呈現形式為中位數(四分位數)表示,即M(P25～P75)。在對比多組間數據方面,若為正態分布,同時方差齊性,則進行單因素方差分析法(ANOVA)檢驗,兩兩對比選擇LSD法,差異顯著,具有統計學意義的標準為“P＜0.05”,上述數據統計工作均在SPSS20.0軟件中完成,制圖采用Garphpad prism8.0完成。

2 結果

2.1 各組大鼠體重變化

在體重方面,對比未造模時,造模4周后各組間無明顯差異(P＞0.05,P=0.05),在體重差值上,各組間差異顯著(P＜0.05),各模型組實驗動物體重與Control組比較差異無統計學意義(P＞0.05),就體重前后差值而言,相較于Control組,M-A組、M-B組差異顯著具有統計學意義(P＜0.05),結果見表1。

表1 各組大鼠造模前后體重比較(±s,n=5)Table1 Comparison of body weight of rats before and after modeling

表1 各組大鼠造模前后體重比較(±s,n=5)Table1 Comparison of body weight of rats before and after modeling

注:與Control組比較,P＞0.05。Note.Compared with the control group,P＞0.05.

組別Groups造模前體重(g)Body weight before modeling造模后體重(g)Body weight after modeling正常組Control group 232.40±16.74 395.60±27.22模型A組M-A group 237.00±18.38 358.20±25.27模型B組M-B group 241.80±20.99 358.00±20.10模型C組M-C group 247.80±28.42 393.00±37.47

2.2 各組大鼠生化指標

2.2.1 各組腎功能比較

同Control組相比,另外3個模型組sUA表達水平示差異顯著(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05)。M-A組、M-B組及M-C組的大鼠對比于Control組,在BUN水平上差異不顯著,無統計學意義(P＞0.05),與Control組相比,M-B組、M-C組的sCr水平明顯升高,差異具有統計學意義(P＜0.05,P＜0.01)。結果見表2。

表2 造模4周后各組大鼠血清尿酸、尿素氮及肌酐水平變化情況(±s,n=5)Table2 Changes in serum uric acid,urea nitrogen and creatinine levels of rats in each group for4consecutive weeks

表2 造模4周后各組大鼠血清尿酸、尿素氮及肌酐水平變化情況(±s,n=5)Table2 Changes in serum uric acid,urea nitrogen and creatinine levels of rats in each group for4consecutive weeks

注:與Control組比較,?P＜0.05,??P＜0.01。Note.Compared with the control group,?P＜0.05,??P＜0.01.

組別Groups血尿酸(μmol/L)Serum uric acid尿素氮(mmol/L)Blood urea nitrogen血肌酐(mmol/L)Serum creatinine正常組Control group 84.75±17.05 7.18±1.07 35.00±5.16模型A組M-A group 503.00±92.65?? 7.52±0.87 47.80±9.88模型B組M-B group 482.25±136.50? 6.35±1.18 54.50±16.54?模型C組M-C group 475.75±99.08? 6.02±1.10 61.50±7.72??

2.2.2 各組大鼠血脂結果比較

M-B組的TG明顯低于Control組(P＜0.05),而3個模型組的TC較Control組無明顯差異(P＞0.05)。Control組的LDL-C、HDL-C,M-B組的HDLC,M-C組的LDL-C整體檢驗組間差異均不顯著(P＞0.05)(見表3)。

表3 連續4周造模各組大鼠血脂水平變化情況,(±s,M(P25～P75),n=5)Table3 Changes in blood lipid levels of rats in each group for4consecutive weeks

表3 連續4周造模各組大鼠血脂水平變化情況,(±s,M(P25～P75),n=5)Table3 Changes in blood lipid levels of rats in each group for4consecutive weeks

注:與Control組比較,?P＜0.05。Note.Compared with the control group,?P＜0.05.

組別Groups甘油三酯TG(mmol/L)總膽固醇TC(mmol/L)低密度脂蛋白LDL-C(mmol/L)高密度脂蛋白HDL-C(mmol/L)正常組Control group 0.77±0.19 1.02±0.43 0.12(0.11～0.12) 0.48(0.44～0.49)模型A組M-A group 0.71±0.21 1.21±0.21 0.13(0.12～0.15) 0.53(0.47～0.58)模型B組M-B group 0.49±0.19? 1.04±0.10 0.12(0.11～0.13) 0.45(0.42～0.51)模型C組M-C group 0.67±0.72 1.15±0.11 0.11(0.10～0.12) 0.55(0.47～0.58)

2.3 各組大鼠腎組織病理結果

2.3.1 HE及Masson

HE染色結構表明,正常組大鼠在顯微鏡下觀察到腎組織結構無異常,腎小管上皮細胞未見水腫,整齊排列,腎小球未見硬化且大小均勻,未見炎癥細胞分布于腎間質,腎小管未見擴張、萎縮,形態正常,未見其他病理改變。而M-A組、M-B組及MC組相比于Control組,腎小球未見明顯病理變化,此外,M-A組中可見部分腎小管擴張,無腎小球萎縮等改變,在M-B組、M-C組中,眾多炎性細胞分布于腎間質,腎小管大幅擴張,此外,光鏡下可見腎小管上皮細胞萎縮以及刷狀緣脫落,細胞核數量大幅度下降,還觀察到腎小管間質部位存在眾多炎癥細胞。在腎病理評分上,比較M-A組與Control組差異無統計學意義(P＞0.05),然而M-B組、M-C組相較于Control組腎病理評分顯著升高(P＜0.01)。通過Masson染色形態學觀察可知,Control組腎小球及腎間質紅染,未見明顯膠原纖維,M-A組與Control組比可見少量的腎間質出現藍紫色膠原纖維沉積(P＜0.05)。而M-B組、M-C組可見明顯的膠原纖維沉積于腎小球和腎間質CVF升高(P＜0.01)(圖1～圖3)。

圖1 各組大鼠腎病理結果比較Figure1 Comparison of pathological results of rat kidney tissues in each group

圖2 各組大鼠腎病理形態學變化Figure2 Pathological changes of the kidneys in each group

圖3 各組大鼠腎Masson染色Figure3 Masson staining of kidney of rats in each group

2.3.2 炎癥CD68的表達變化

CD68屬于巨噬細胞標記蛋白其中之一,可反映巨噬細胞的浸潤程度,從而了解腎間質的炎癥情況。其中棕色部分為CD68陽性表達區域,利用CD68表達面積與整個視野面積百分比值(%)來評估腎間質炎癥。與Control組相比,M-A組可見少量棕色表達部分(P＜0.05),M-B、M-C組可見眾多巨噬細胞浸潤,具有明顯的腎間質炎癥反應(P＜0.01)(表4、圖4～圖7)。

2.3.3 上皮細胞-間充質轉分化及纖維化的變化

E-Cadherin(E-鈣粘蛋白)陽性表達區域為細胞膜和(或)細胞質,作為上皮細胞標志物,其陽性表達率越低,說明上皮細胞數量愈低,上皮細胞-間充質細胞轉分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)程度愈甚。相比于Control組大鼠,M-A組ECadherin表達量有所下降,但統計學沒有意義(P＞0.05),而M-B、M-C組可見明顯的棕色表達量降低(P＜0.01)(表4、圖4～圖7)。α-SMA(α-平滑肌肌動蛋白)是肌成纖維細胞、纖維細胞受損激活和表型轉化的標志蛋白,其表達增加,可使腎纖維化的進展更快[8]。與Control組相比,M-A組可見少量的α-SMA的表達(P＜0.05),此外,M-A組、M-B組表達量明顯增加(P＜0.01)(見表4、圖4～圖7)。

圖4 各組大鼠免疫組化CD68、E-Cadherin、α-SMA蛋白陽性表達面積Figure4 Immunohistochemical positive expression areas of CD68,E-Cadherin and α-SMA in each group

圖5 各組大鼠免疫組化CD68蛋白陽性表達Figure5 Immunohistochemical positive expression of CD68protein in each group

圖6 各組大鼠免疫組化E-Cadherin蛋白陽性表達Figure6 Immunohistochemical positive expression of E-Cadherin protein in each group

圖7 各組大鼠免疫組化α-SMA蛋白陽性表達Figure7 Immunohistochemical positive expression of α-SMA protein in each group

表4 各組大鼠CD68、E-Cadherin、α-SMA陽性面積百分比(±s,%,n=5)Table4 Percentage of CD68,E-Cadherin and α-SMA positive area of rats in each group

表4 各組大鼠CD68、E-Cadherin、α-SMA陽性面積百分比(±s,%,n=5)Table4 Percentage of CD68,E-Cadherin and α-SMA positive area of rats in each group

注:與Control組比較,?P＜0.05,??P＜0.01。Note.Compared with the control group,?P＜0.05,??P＜0.01.

組別Groups CD68 E-Cadherin α-SMA正常組Control group 3.30±0.73 7.50±0.87 1.22±0.34模型A組M-A group 6.41±0.84?? 6.99±0.99 1.94±0.64?模型B組M-B group 11.16±1.28?? 4.44±0.86?? 6.95±1.79??模型C組M-C group 12.17±1.79?? 2.06±0.86?? 9.95±2.09??

3 討論

目前常用于高尿酸造模的方法有抑制尿酸酶活性如氧嗪酸類藥物及Uox基因敲除兩種,尿酸的前體物質腺嘌呤法和次黃嘌呤法,增加黃嘌呤氧化酶活性的酵母法以及經過體內嘌呤代謝尿酸法。單純應用氧嗪酸鉀很難誘導大鼠出現UAN,加大氧嗪酸鉀劑量又會存在增加動物死亡率的風險[9];腺嘌呤雖然可以引起血尿酸、血肌酐的升高,其代謝產物2,8-二羥基腺嘌呤可直接沉積于腎小管,損傷腎,與尿酸所引起的腎損傷并不一致[10-11];酵母雖可干擾體內尿酸代謝,升高血尿酸,但是酵母溶液灌胃會引起動物飽腹感,且過多的灌胃次數無疑增加勞動成本,雖然有研究者將其混于飼料中飼喂,但是容易造成飼料浪費,且難準確掌握造模所用藥物劑量,隨著造模后期大鼠的狀態不佳,食量明顯減少,血尿酸升高程度不穩[12]。然而,以上方法皆有需完善之處。使用氧嗪酸鉀聯合不同尿酸濃度的方法灌胃,不僅可以抑制尿酸在大鼠體內分解代謝,而且通過直接攝入尿酸,在大幅度提升sUA水平的同時,腎損傷成模期限縮短,此外,尿酸該UAN模型中致腎損傷的唯一因素,且較于腺嘌呤法,該方式所致腎損傷程度更輕[6]。該種造模方式所引起的病變過程以及腎損傷程度均接近于人類

UAN[13]。既往文獻報道,大部分研究者選取氧嗪酸鉀與尿酸混合成飼料或者氧嗪酸鉀飼料飼喂聯合尿酸灌胃,但飼喂方法易使大鼠產生飽腹感,食欲受限,造成不穩定的模型,不利于探究后續的藥物干預實驗[14]。國內研究人員嘗試以不同劑量的氧嗪酸鉀和尿酸制成的懸液形式對小鼠進行灌胃,1周后觀察到sUA顯著增加且無腎損傷。我國也有不同劑量的氧嗪酸鉀和尿酸混懸液灌胃的方法,1周后小鼠sUA明顯升高,但未觀察到腎組織明顯損傷[15]。通過灌胃該方式可控性較強,因此,我們決定選用氧嗪酸鉀與不同劑量尿酸混合給予實驗大鼠灌胃方式造模,保證造模藥物精確攝入,同時使灌胃次數減少。

本研究結果顯示,與正常組相比(163.20±24.55),氧嗪酸鉀聯合低劑量、中劑量尿酸(121.20±22.82、116.20±17.63)造模前后體重差值明顯降低,考慮在造模藥物刺激下,大鼠食欲受限,而氧嗪酸鉀聯合高劑量尿酸(145.20±31.49)組差異不明顯,考慮組內差異較大。灌胃4周后,氧嗪酸鉀(750mg/kg)聯合低劑量(150mg/kg)、中劑量(300 mg/kg)及高劑量(600mg/kg)尿酸組大鼠較于正常組sUA水平明顯升高約6倍,但是各模型組間的sUA水平在并未存在尿酸劑量依賴性。BUN和sCr作為常用評估腎功能的生化指標,常用來評估腎功能情況,在造模4周后,氧嗪酸鉀聯合中劑量、高劑量尿酸組較正常組sCr水平分別升高約1.5倍、1.7倍。在此研究中所采用的UAN大鼠模型相比于腺嘌呤誘導UAN模型的方法,腎功能不全程度相對更輕[11,16]。造模4周后,各模型組BUN水平對比于正常組,升高不顯著,考慮各組腎功能不全程度可能與此有關。有研究顯示BUN可被腎小管重吸收,只有當腎小球濾過率降低在60%以上時,BUN才會大幅升高,且對于腎功能判斷,sCr敏感程度高于BUN[17]。此外,我們發現UAN大鼠的血脂也有所改變通過我們的觀察顯示,氧嗪酸鉀聯合低劑量未出現TG明顯變化,當出現腎功能減退時,氧嗪酸鉀聯合中劑量和高劑量尿酸反而降低了血清TG水平,其中氧嗪酸鉀聯合中劑量尿酸TG降低更為顯著,而氧嗪酸鉀聯合中劑量尿酸組的血尿酸水平也高于高劑量尿酸組,說明尿酸本身對大鼠甘油三酯代謝存在影響,目前具體機制并尚不明確。既往臨床報道HUA或UAN患者易伴發高TG血癥[18-19],而我們的研究與之相反。與其他UAN造模方法相比較,考慮可能與造模藥物中所選用的尿酸相關,因為尿酸可不通過肝的嘌呤代謝,從而直接導致sUA水平上升。

此外,我們構建的UAN大鼠腎病變部位主要集中在腎小管間質,腎組織病理HE染色顯示,與正常組相比,氧嗪酸鉀聯合低劑量尿酸組中僅出現部分腎小管擴張,未見萎縮及炎癥浸潤,而氧嗪酸鉀聯合中劑量、高劑量尿酸組可見明顯的腎小管擴張以及萎縮的腎小管上皮細胞、脫落的刷狀緣和細胞核數量大幅降低,腎間質區分布著大量的炎性細胞。此外,經由Masson染色結果發現,氧嗪酸鉀聯合中劑量、高劑量尿酸藍色膠原纖維所占比例明顯增加。CD68作為炎癥蛋白,我們研究結果顯示氧嗪酸鉀聯合低劑量、中劑量、高劑量尿酸組的大鼠腎CD68表達量均有所增加,這與以往報道結果相似,尿酸可以激活腎組織和腎小管上皮細胞中NLRP3炎性小體的活化和凋亡[20],致因可能為尿酸對腎小管上皮細胞刺激所致。另外腎小管間質區被大量炎性細胞浸侵,尤其是巨噬細胞,而尿酸可激活巨噬細胞中LR4/MyD88/NFκB通路,同時多種炎癥細胞因子被釋放,如IL-1β、TNF-α、MCP-1等[21]。此外,,而腎小管EMT作為腎小管間質纖維化的早期標志,在腎小管間質纖維化發生之前可存在,而腎小管間質纖維化則是慢性腎病的主要特性之一。研究顯示,尿酸誘導大鼠腎小管上皮細胞中α-SMA以及波形蛋白表達的增加而降低E-Cadherin的表達,說明了EMT的發生[22],而尿酸鹽性腎病也能刺激TGF-β的產生和激活NLRP3炎性小體從而調節腎炎癥和纖維化[23]。鑒此我們檢測了E-Cadherin和α-SMA在該UAN模型大鼠腎中的表達變化,氧嗪酸鉀聯合中劑量、高劑量尿酸組的大鼠腎E-Cadherin表達量較正常組明顯降低,而α-SMA達量均有所增加,說明氧嗪酸鉀聯合中劑量、高劑量尿酸組的大鼠都有不同程度的損傷。在尿酸刺激下,腎小管細胞可產生分泌促纖維化前體物質,如NF-κB通路被尿酸激活后,能夠促進腎小管上皮細胞賴氨酰氧化酶、細胞間黏附分子1和血管細胞粘附分子1的表達,導致細胞外基質合成提高,由此引發間質纖維化[24]。

氧嗪酸鉀(750mg/kg)聯合低劑量(150mg/kg)、中劑量(300mg/kg)、高劑量(600mg/kg)尿酸在干預大鼠4周后,皆會導致大鼠sUA水平大幅度上調,其中氧嗪酸鉀聯合低劑量尿酸即出現輕微的炎癥變化,但氧嗪酸鉀聯合中劑量、高劑量尿酸炎癥變化較為明顯,且只有氧嗪酸鉀聯合中劑量、高劑量尿酸才有顯著的EMT改變和腎間質纖維化改變。綜上所述,大鼠腎功能異常和腎病理損傷的情況均只出現在氧嗪酸鉀聯合中、高劑量尿酸組,而且,在造模4周的期限中,中、高劑量模型組中腎損傷程度差異尚不明顯,由此,我們認為氧嗪酸鉀(750mg/kg)聯合中劑量尿酸(300mg/kg)連續灌胃誘導大鼠4周可作為構建UAN大鼠模型較為理想的方法。