基于miR-223/NLRP3 軸研究柚皮素對氧誘導視網膜病變中小膠質細胞活化的影響

楚瑞雪,孫先桃,王 惠

(鄭州大學附屬兒童醫院,河南省兒童醫院,鄭州兒童醫院眼科,鄭州 450000)

早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity,ROP)是發生在早產兒、低出生質量兒的視網膜血管異常增生疾病,現已成為兒童致盲和視力損傷的主要原因[1]。目前治療ROP的主要方法包括抗血管內皮生長因子、激光術、冷凝術等,但治療后部分患兒仍出現視覺異常甚至失明現象[2],因此,探求更有效的治療方法是臨床上ROP治療關鍵。隨著研究深入,發現小膠質細胞異常活化可以影響視網膜新生血管的形成,且炎癥能夠激活小膠質細胞異常活化[3-4],推測炎癥可能是ROP形成的原因之一。柚皮素(naringenin,NAR)作為抗炎、抗氧化的黃酮類化合物,能夠通過抑制小膠質細胞的活化從而緩解小鼠記憶功能[5],但其在ROP中的作用機制尚未發現研究。微小RNA(microRNA,miR)-223在單核/巨噬細胞和胚胎干細胞分化、破骨細胞形成等方面發揮重要作用,研究發現,上調miR-223后可以抑制核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein3,NLRP3)炎癥體表達,進而可以改善脂多糖誘導的小膠質細胞的過度活化現象[6],推測NAR亦可能通過miR-223/NLRP3軸發揮作用。因此,本文建立氧誘導視網膜病變(oxygen induced retinopathy,OIR)模型,通過體內實驗觀察NAR對OIR的影響,并初步探討其作用機制,為臨床上ROP的治療提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

30只健康成年SPF級C57BL/6J小鼠(雌性:雄性=2∶1),8周齡,體重(23±2)g,均購自中國醫學科學院醫學生物學研究所[SCXK(滇)K2019-0002]。小鼠均在鄭州大學(藥物研究院)動物實驗室飼養[SYXK(豫)2018-0004],飼養條件:單個分籠飼養,均在溫度(25.0±0.5)℃、濕度(45±5)%、12 h光照12h黑暗條件下自由飲食攝水,并保持飼養環境透氣、干凈。20只雌性小鼠和10只雄性小鼠適應性飼養1周后,按雌雄2∶1合籠交配,雌性小鼠懷孕后取出單獨飼養,并足日齡產下幼鼠,其中150只幼鼠母乳喂養至7日齡(postnatal7,P7),進行隨機分組,開始后續實驗。實驗動物符合3R原則,經本院動物倫理審查委員會審查(IACUC:2020090123),符合動物倫理。

1.2 主要試劑與儀器

羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose,CMC)(伊士曼,執行標準:GB/T5005-2001);NAR(美國Sigma公司,批號:192025,純度≥95%);miR-223拮抗劑陰性對照、miR-223拮抗劑均購自廣州銳博生物科技公司;miRNA提取分離試劑盒、miRNA反轉錄試劑盒(TIANGEN,批號分別為:20201006、20201205);熒光素鈉注射液(廣州白云山明興制藥有限公司,批號:20190206);一抗小膠質細胞標志物鈣離子結合蛋白-1(ionized calcium binding adapter-1,Iba-1)、NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)、白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18,Alexa Fluor?488標記的熒光二抗(英國abcam公司,批號分別為:12-NOV-2019、05-DEC-2020、26-JAN-2020、08-Nov-2019、02-NOV-2020、09-FEB-2020)。眼底熒光造影儀(上海伊沐醫療器械有限公司,型號:SK-650B);實時熒光定量PCR(real time quantitative PCR,RT-qPCR)儀(美國ABI公司,型號:StepOnePlus);蛋白凝膠成像儀(賽默飛世爾,型號:iBright CL750)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物建模與分組

實驗前所有幼鼠均用眼科裂隙燈觀察眼部,均未發現異常。150只幼鼠按照隨機數字表法分為常氧組、OIR組、NAR組、NAR+陰性對照組、NAR+miR-223拮抗劑組,每組30只。除常氧組外,其余各組參考文獻[7],幼鼠及其母鼠在P7～P12移至封閉氧箱中,氧氣體積分數(75±2)%,連續5d,P12返回正常氧環境中。常氧組在正常氧環境中常規飼養。

250mg CMC溶于ddH2O中,定容至100mL過夜。1.0g NAR溶于含CMC的溶劑中,定容100 mL,配置成10mg/mL溶液備用。NAR組幼鼠腹腔注射100mg/(kg·d)NAR,NAR+陰性對照組在NAR基礎上P12尾靜脈注射2.5mg/kg miR-223拮抗劑陰性對照,NAR+miR-223拮抗劑組在NAR基礎上P12尾靜脈注射2.5mg/kg miR-223拮抗劑,常氧組、OIR組每天腹腔注射等體積CMC、P12尾靜脈注射等體積生理鹽水。P17檢測幼鼠各項指標。

1.3.2 RT-qRCR檢測視網膜中miR-223水平

每組隨機取10只,小心取下視網膜,置于-80℃冰箱保存備用;miRNA提取試劑盒提取miRNA,非變性凝膠電泳檢測提取質量,miRNA反轉錄試劑盒將miRNA反轉錄成cDNA。miR-223上游引物:5’-GGTGGTGAATACCCTCCTG-3’,下游引物:5’-GTCTGTCCGTGGTGCTGA-3’;U6上游引物:5’-AAGACGGGCGGAGAGAAACC-3’,下游引物:5’-CGTTGACTCCGACCTTCACC-3’。RT-qPCR儀檢測miR-223水平。20μL反應體系:50ng/μL cDNA1μL,10μmol/L上游引物/下游引物0.5μL/0.5μL,2×Hi SYBR Green QPCR Mix10μL,ddH2O 8.0μL。反應條件:95℃、5min;94℃、50s,59℃、30s,40個循環,72℃、10min。2-ΔΔCT法計算miR-223水平。

1.3.3 熒光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)檢查

每組隨機取10只,幼鼠散瞳、2mL/kg10%熒光素鈉注射液腹腔注射,待熒光素鈉循環至眼底時,眼底熒光造影儀以視盤和激光光凝為中心對幼鼠行FFA檢查。

1.3.4 HE染色觀察視網膜形態

每組取剩余10只,處死后取眼球,置于4%多聚甲醛中固定。左眼球石蠟包埋后平行眼軸方向連續切片(切片厚度5μm),切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、蘇木精染色、1%鹽酸乙醇分色后,伊紅染色,再經梯度乙醇脫水、二甲苯透明,封片觀察。

1.3.5 免疫熒光檢測視網膜中Iba-1表達情況

4%多聚甲醛中固定的右眼球在4℃經20%和30%蔗糖溶液脫水,冰凍切片機平行眼軸方向連續切片(切片厚度6μm),切片經0.3% Trition處理30min,加入山羊血清37℃封閉1h,隨后加入一抗Iba-1(1∶1000),第2天洗去一抗滴加熒光二抗(1∶500)室溫孵育1h,統計單位面積Iba-1陽性細胞數。

1.3.6 Western blot檢測視網膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18蛋白表達情況

-80℃中取出視網膜,加100μL組織勻漿液勻漿,10000r/min4℃離心20min,上清(即為總蛋白)置于新的離心管中,每孔上樣20μg,凝膠電泳分離蛋白,PVDF膜轉膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2h,PBST清洗后分別添加一抗NLRP3(1∶1000)、Caspase-1(1∶1000)、IL-1β(1∶500)、IL-18(1∶500),4℃孵育過夜;PBST清洗后加入對應二抗,室溫孵育1h。DAB顯色試劑盒避光顯色,蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.4 統計學方法

統計學軟件GraphPad Prism8.0進行數據分析,計量數據以平均數±標準差(±s)描述,多組間比較用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q法。P＜0.05,差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NAR對視網膜中miR-223水平的影響

與常氧組相比,OIR組視網膜中miR-223水平降低(P＜0.05);與OIR組相比,NAR組、NAR+陰性對照組視網膜中miR-223水平升高(P＜0.05);分別與NAR組、NAR+陰性對照組相比,NAR+miR-223拮抗劑組視網膜中miR-223水平降低(P＜0.05)。見表1。

2.2 NAR對FFA的影響

常氧組熒光分布均勻;OIR組出現血管破裂(黑色箭頭),熒光漏在視網膜中,視網膜泛白,血管出現收縮;NAR組、NAR+陰性對照組血管破裂現象緩解,視網膜泛白現象減輕;NAR+miR-223拮抗劑組血管破裂,熒光漏在視網膜中,視網膜泛白明顯。見圖1。

圖1 5組幼鼠FFA情況Figure1 FFA situation of the young mice of5groups

2.3 NAR對視網膜形態的影響

常氧組各層次細胞排列整齊且緊密;OIR組視網膜厚度變厚、細胞排列松散,部分出現細胞缺失現象、血管新生現象(黑色箭頭);NAR組、NAR+陰性對照組視網膜變厚、細胞松散現象存在,未見新生血管;NAR+miR-223拮抗劑組細胞松散嚴重、細胞缺失明顯。見圖2。

圖2 5組幼鼠視網膜形態情況(HE染色)Figure2 Morphology of retina in the young mice of5groups(HE staining)

2.4 NAR對視網膜中Iba-1表達的影響

與常氧組相比,OIR組視網膜中Iba-1水平升高(P＜0.05);與OIR組相比,NAR組、NAR+陰性對照組視網膜中Iba-1水平降低(P＜0.05);分別與NAR組、NAR+陰性對照組相比,NAR+miR-223拮抗劑組視網膜中Iba-1水平升高(P＜0.05)。見圖3、表1。

圖3 5組幼鼠視網膜中Iba-1表達情況(免疫熒光)Figure3 Iba-1expression in the retina of the young mice of5groups(immunofluorescence)

表1 5組視網膜中miR-223水平及Iba-1表達比較(±s,n=10)Table1 Comparison of miR-223levels and Iba-1in the retinas of the5groups

表1 5組視網膜中miR-223水平及Iba-1表達比較(±s,n=10)Table1 Comparison of miR-223levels and Iba-1in the retinas of the5groups

注:與常氧組相比,#P＜0.05;與OIR組相比,?P＜0.05;與NAR組相比,△P＜0.05;與NAR+陰性對照組相比,▲P＜0.05。Note.Compared with normal oxygen group,#P＜0.05.Compared with OIR group,?P＜0.05.Compared with NAR group,△P＜0.05.Compared with NAR+negative control group,▲P＜0.05.

組別Groups miR-223 Iba-1(cells/mm2)常氧組Normal oxygen group 1.01±0.12 15.35±2.71 OIR組OIR group 0.38±0.05# 83.43±11.75#NAR組NAR group 0.74±0.07? 28.56±3.16?NAR+陰性對照組NAR+negative control group 0.75±0.06? 30.15±4.48?NAR+miR-223拮抗劑組NAR+miR-223antagomir group 0.26±0.03△▲ 76.18±8.15△▲

2.5 NAR對視網膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達的影響

與常氧組相比,OIR組視網膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白水平升高(P＜0.05);與OIR組相比,NAR組、NAR+陰性對照組視網膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白水平降低(P＜0.05);分別與NAR組、NAR+陰性對照組相比,NAR+miR-223拮抗劑組視網膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白水平升高(P＜0.05)。見圖4、表2。

表2 5組幼鼠視網膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達比較(±s,n=10)Table2 Comparison of NLRP3,Caspase-1,IL-1β and IL-18protein expression in the retina of young mice in the5groups

表2 5組幼鼠視網膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達比較(±s,n=10)Table2 Comparison of NLRP3,Caspase-1,IL-1β and IL-18protein expression in the retina of young mice in the5groups

注:與常氧組相比,#P＜0.05;與OIR組相比,?P＜0.05;與NAR組相比,△P＜0.05;與NAR+陰性對照組相比,▲P＜0.05。Note.Compared with normal oxygen group,#P＜0.05.Compared with OIR group,?P＜0.05.Compared with NAR group,△P＜0.05.Compared with NAR+negative control group,▲P＜0.05.

組別Groups NLRP3 Caspase-1 IL-1β IL-18常氧組Normal oxygen group 0.56±0.08 0.09±0.01 0.05±0.01 0.21±0.03 OIR組OIR group 1.13±0.12# 1.56±0.17# 1.73±0.18# 1.03±0.11#NAR組NAR group 0.69±0.08? 0.24±0.03? 0.45±0.05? 0.31±0.03?NAR+陰性對照組NAR+negative control group 0.70±0.06? 0.26±0.04? 0.46±0.06? 0.32±0.04?NAR+miR-223拮抗劑組NAR+miR-223antagomir group 1.02±0.05△▲ 1.05±0.10△▲ 0.81±0.09△▲ 0.93±0.08△▲

圖4 5組幼鼠視網膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達情況Figure4 NLRP3,Caspase-1,IL-1β,IL-18protein expression in the retina of young mice in the5groups

3 討論

ROP又稱晶狀體后纖維增生癥,是視網膜正常血管化停滯,新生血管異常增生,嚴重情況下會牽拉視網膜脫落,損害視力,甚至失明,即使患兒未失明,視網膜光感受器細胞發育異常,患兒出現斜視、弱視、屈光不正等的幾率也極高[8]。隨著研究深入,發現感染在ROP發生、發展中起一定作用,骨髓造血干細胞來源的巨噬細胞遷移至視網膜中并分化成小膠質細胞。小膠質細胞能夠參與免疫系統的免疫監視,損傷情況下小膠質細胞激活,在初期可以作為抗原呈遞細胞,吞噬壞死的視網膜神經節細胞碎片,但小膠質細胞過度激活還可分泌一系列炎癥因子,發揮炎癥作用[9-10]。且在ROP中小膠質細胞過度活化傳遞缺氧信號,促進視網膜血管新生[11]。本研究以小鼠出生7d幼鼠為研究對象,OIR處理模擬ROP癥狀,研究發現,OIR中FFA可見血管破裂嚴重,熒光漏在視網膜中,視網膜泛白,血管出現收縮現象;HE染色可見視網膜出現血管新生現象、細胞排列紊亂,提示OIR在一定程度上可以模擬ROP現象。研究發現,小膠質細胞主要集中在神經纖維層、內核層和外叢狀層,本研究對小膠質細胞標志物Iba-1免疫熒光染色發現,在常氧組中僅有少量活化的小膠質細胞,可能用于對正常代謝的視網膜碎片進行清理,但在OIR組中視網膜相同部位出現大量活化的小膠質細胞,可能影響血管破裂、增生。中醫作為傳統醫學,中草藥的治療對于疾病意義重大,其中NAR作為中藥中重要成分,廣泛存在于植物和中藥中,研究發現,其在糖尿病視網膜病變大鼠氧化損傷、細胞凋亡等過程中發揮重要作用[12]。在本研究中,NAR可以減輕血管新生現象,降低小膠質細胞活化現象,從而緩解OIR,但其具體機制尚需進一步研究。

miRNA存在于哺乳動物體內,通過轉錄后基因表達從而參與調控表觀遺傳[13],miR-223一直認為是與造血、免疫相關的特異性miRNA,miR-223存在于血管內皮細胞中,在血管新生中處于下調狀態,能夠拮抗血管新生[14];作為髓系細胞中表達miRNA,能夠調控免疫細胞發育和維持免疫細胞穩態[15],能夠通過調控多種炎癥相關因子表達從而調控單核細胞的分化和巨噬細胞極化[16]。NLRP3作為miR-223的靶基因之一[17],是中樞神經系統炎癥小體,可觸發炎癥反應過程,在OIR視網膜中處于高表達狀態[18]。NLRP3可以與效應分子結合形成成熟的炎癥小體和成熟的Caspase-1,Caspase-1作為IL-1β、IL-18特異有效的蛋白酶,激活后的Caspase-1能夠促進炎癥因子IL-1β、IL-18的表達,IL-1β、IL-18進一步發揮致炎促損傷作用[19-20]。本研究發現,在OIR視網膜中miR-223處于低表達狀態,NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白水平均升高,提示在OIR中miR-223表達降低,從而升高NLRP3的表達,發揮作用。NAR組較OIR組視網膜中miR-223水平升高、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白水平降低,而在NAR組的基礎上添加miR-223拮抗劑后可以逆轉上述過程,提示NAR能夠升高miR-223水平、降低NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白水平,實現對小膠質細胞活化的緩解,進而抑制血管新生。

綜上所述,NAR能夠上調miR-223的表達進而抑制NLRP3炎癥小體的表達,緩解視網膜炎癥作用,進而緩解小膠質細胞過度激活,實現對OIR的保護。但miR-223下游靶基因眾多,亦可能通過別的基因發揮作用,且小膠質細胞過度激活機制復雜,需進一步研究發現其機制。