膜細胞對化療損傷性顆粒細胞的影響及左歸丸含藥血清干預作用

孫曉峰,黃欣怡,曾貴榮,龔力民,喬 江,陽松威,周 琳

(1.湖南中醫藥大學醫學院,長沙 410208;2.湖南省藥物安全評價研究中心＆新藥藥效與安全性評價湖南省重點實驗室,長沙 410331;3.湖南中醫藥大學藥學院,長沙 410208;4.湖南中醫藥大學附屬第一醫院婦產科,長沙 410007;5.長沙醫學院,長沙 410219)

女性因使用化療藥物所導致卵巢儲備功能在40歲之前衰竭稱為化療性卵巢早衰(premature ovarian failure,POF),可導致繼發性閉經并伴隨血促性腺激素升高和雌激素下降所引起的一系列癥狀,此類患者罹患骨質疏松、心血管疾病等疾病風險性也明顯增加。隨著腫瘤疾病的明顯年輕化以及病人對生育和生活質量的要求,如何改善化療性卵巢早衰愈受關注[1-2]。發育中的卵泡由卵母細胞(oocyte,OC)、顆粒細胞(granulosa cells,GC)及膜細胞(theca cell,TC)組成,三者相互作用維持卵泡的生長發育以及卵巢的功能[3-4]。GC為OC提供支持和營養,TC與GC密不可分,為優勢卵泡提供穩定的雌激素微環境,同時也是女性雌激素的主要來源。化療藥物的效果取決于它對快速分裂細胞的破壞能力,常用的化療藥物環磷酰胺對卵巢損傷作用不僅表現為其對生長期卵泡中GC增殖和OC發育的破壞,也可以通過損傷DNA的方式破壞靜止期的原始卵泡,從而減小原始卵泡池的大小,降低卵巢儲備。本團隊及其他研究均提示化療性POF動物模型中GC凋亡率上升,而左歸丸可減少GC凋亡率,在一定程度上恢復卵巢功能[5-6]。環磷酰胺的體外活性成分磷酰胺氮芥(phosphoramide mustard,PM)在體外可通過促進凋亡和自噬過程損傷GC;此種損傷能被10%左歸丸(ZGW)含藥血清通過影響GC自噬和凋亡過程所緩解[7],目前關于TC的研究較少,其作用往往被小覷。本研究進一步探討TC對化療損傷性GC的影響以及左歸丸含藥血清對TC和GC共培養的干預機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物SPF級雌性SD大鼠20只,體重250～270g,8周齡,用于制備含藥血清,由湖南省斯萊克景達實驗動物有限公司提供[SCXK(湘)2019-0015],動物飼養于湖南省藥物安全評價研究中心SPF環境[SYXK(湘)2020-0015]。動物實驗經湖南省藥物安全評價研究中心倫理委員會批準(2020014),過程中遵循實驗動物學的3R原則。

1.1.2 細胞

原代大鼠卵巢GC(賽百慷上海生物技術股份有限公司,批號:iCell20191027)。原代大鼠卵巢TC(賽百慷上海生物技術股份有限公司,批號:iCell201912025)。

1.2 主要試劑與儀器

左歸丸由熟地、菟絲子、枸杞、川牛膝、山茱萸、山藥、鹿角膠、龜板膠組成,購自北京同仁堂。按原配方比制成含1g/mL生藥的浸膏。磷酰胺氮芥(江蘇倍達,20180908);GC專用培養基(iCell,PriMed-iCell-028);TC專用培養基(iCell,PriMediCell-042);RIPA蛋白裂解液(碧云天,P0013B);BCA蛋白定量試劑盒(碧云天,P0012S);二抗(Anti Rabbit IgG/HRP,Abclonal,AS014,);β-actin內參(Abclonal,AC026);兔 抗Beclin-1(Abclonal,A7353);兔抗Caspase-3(Abclonal,A19654);兔抗Bax(Abclonal,A19684);兔 抗p62(Abclonal,A19700);兔 抗LC3B(Abclonal,A19665);High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Thermo Fisher Scientific,EP0742);PowerUp SYBR Green Master Mix(Thermo Fisher Scientific,A25742)。引物(上 海 生 工)。Fast Pure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit(Vazyme,RC101-01);化學發光儀(博路騰);倒置顯微鏡(OLYMPUS IX71);電泳儀(北京六一);實時熒光定量PCR儀(Thermo Fisher,7500);分光光度計(Thermo Fisher,NanoDrop Lite)。

1.3 實驗方法

1.3.1 左歸丸含藥血清制備與給藥

SD大鼠隨機分2組:左歸丸含藥血清組和正常血清組各10只。1g/mL的左歸丸浸膏,按照245.7 g/(kg·d)劑量(根據成人與大鼠體表面積的換算公式計算出的大鼠用藥量,相當于臨床等效劑量的9倍),每天分2次給左歸丸含藥血清組動物連續灌服3d,正常血清組每天分2次給予等量純凈水連續灌服3d,兩組于第3天末次灌胃后的2～2.5h,麻醉后腹主動脈進行采血,靜置30min后,離心并分離血清置于-20℃保存,實驗前于56℃、30min環境滅活,使用0.22μm濾器過濾后使用。

1.3.2 造模與分組

分為8組:(1)空白對照組:10%正常血清專用培養基培養48h;(2)共培養組:10%正常血清專用培養基,并插入培養用TC細胞的小室于孔板之上,培養48h;(3)ZGW血清組:10% ZGW血清專用培養基培養48h;(4)ZGW血清+共培養組:10% ZGW血清專用培養基,并插入培養用TC細胞的小室于孔板之上,培養48h;(5)模型組:向10%正常血清專用培養基中加入PM,濃度為30μmol/L,培養24 h后,換液加入10%正常血清專用培養基繼續培養24h;(6)模型+共培養組:向10%正常血清專用培養基中加入PM,濃度為30μmol/L,培養24h后,換液加入10%正常血清專用培養基,并插入培養用TC細胞的小室于孔板之上,繼續培養24h。(7)模型+ZGW血清組:向10%正常血清專用培養基中加入PM,濃度為30μmol/L,培養24h后,換液加入10%ZGW血清專用培養基繼續培養24h;(8)模型+ZGW血清+共培養組:向10%正常血清專用培養基中加入PM,濃度為30μmol/L,培養24h后,換液加入10% ZGW血清專用培養基,并插入培養用TC細胞的小室于孔板之上,繼續培養24h。各組均在37℃,5% CO2細胞培養箱培養。利用0.4μm孔徑的聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)-based小室進行細胞共培養試驗,具體方法如下:先分別制備TC細胞和GC細胞的細胞懸液,進行細胞計數,每組取3×105個細胞,放至1.5mL無菌EP管中,并用其各自專用培養基補齊至600μL。向6孔板中加入2.4 mL含有10%正常血清的GC細胞專用培養基,同時加入200μL事先準備的GC細胞懸液;上面放細胞小室,先向小室中加入1.3mL含有10%正常血清的TC細胞專用培養基,將200μL的細胞懸液輕輕加入小室的上室中,盡量使細胞均勻分布到小室孔內(注意:保證上下室液體相互接觸)。

1.3.3 qRT-PCR法檢測各組目的基因mRNA表達

根據試劑盒要求提取細胞總RNA,檢測RNA純度及濃度后,使用瓊脂糖電泳法檢測RNA完整性。參照試劑盒操作說明,將1μg總RNA反轉錄合成cDNA后進行擴增,反應條件為95℃、10min,95℃、10s,60℃、30s,72℃、15s,循環次數為40次。參照文獻[8]方法分析實驗數據,以2-ΔΔct法(ct表示基本循環值)測定各目的mRNA基因相對表達量。試驗重復3次。各組目的基因引物序列見表1。

表1 各組引物序列Table1 Primer sequence of each group

1.3.4 Western blot檢測各組目標蛋白的表達

棄培養基,用1mL PBS緩沖液漂洗細胞2次,吸掉PBS,用胰酶將細胞消化,使用移液槍反復吹打制成細胞懸液,取細胞懸液置于EP管內,1000r/min的速度離心5min后,去上清,轉移至無菌的1.5 mL EP管中。每管加入200μL細胞裂解液RIPA,用移液槍吸打,將細胞沉淀充分打散至溶液澄清,放入-80℃冰箱反復凍融2次后用超聲破碎儀破碎細胞,放入提前預冷到4℃的離心機,12000r/min,離心10min;將上清轉移到新的1.5mL EP管中,做好標記待用。取80μg蛋白樣品量,加入6×SDS混合,置于105℃高溫變性10min,剩余的蛋白樣品置于-80℃保存。變性后的各組蛋白經SDS凝膠電泳(2～3h)、轉膜(90min)、封閉(60min)、孵一抗(孵育4～6h或4℃過夜)、洗膜(10min×3次)、孵二抗(60min)、再次洗膜(10min×3次)后。使用ECL顯影液進行顯影后,在Tanon-5200系統中,加入化學發光底物檢測熒光信號,進行成像分析。定性和定量分析各組條帶Beclin-1、LC3B、Bax、Caspase-3及p62的表達。實驗重復3次,結果取3次平均值。

1.4 統計學方法

使用SPSS22.0軟件處理數據,計量資料以平均數±標準差(±s)表示。若數據符合正態性和方差齊性,各組間均數比較采用單因素方差分析法;若數據不符合正態性或方差齊性,采用Kruskal-Wallis秩和檢驗方法比較各組間均值。以P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組目標蛋白mRNA基因表達

由圖1中結果所示,用PM處理大鼠卵泡GC后,GC中的Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的mRNA表達增加,p62的表達水平下降;而左歸丸給藥能顯著降低PM處理后GC升高的Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的mRNA水平,同時升高PM處理后GC降低p62的mRNA表達水平;加入TC細胞與GC細胞共培養,同樣可以使化療損傷性的GC細胞中Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的mRNA表達水平降低,p62的表達水平升高,且在模型組中同時加入共培養及左歸丸含藥血清處理后,Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的mRNA表達水平較單純使用共培養或左歸丸含藥血清處理的更低,而p62的表達水平更高。以上差異均具有統計學意義(P＜0.05)。

圖1 各組目的基因mRNA表達量Figure1 mRNA expression of target gene in each group

2.2 各組目標蛋白表達

由圖2中結果所示,用PM處理大鼠卵泡GC后,GC中Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的蛋白表達增加,p62的表達水平下降;而左歸丸給藥能降低PM處理后GC升高的Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的水平,同時升高PM處理后GC降低的p62表達水平;加入TC細胞與GC細胞共培養,同樣可以使GC細胞中Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的表達水平降低,p62的表達水平升高。且在模型組中同時加入共培養及左歸丸含藥血清處理后,Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的蛋白表達水平較單純使用共培養或左歸丸含藥血清處理的更低,而p62的表達水平更高。以上差異均具有統計學意義(P＜0.05)。

圖2 各組目的蛋白表達Figure2 Expression of target proteins in each group

3 討論

作為廣譜抗腫瘤藥物的環磷酰胺,不僅對各種實體瘤、白血病有效,而且是目前應用的各種免疫抑制劑中作用最強、應用最多的藥物之一,由于其良好的臨床療效,應用范圍日益廣泛[9],但其副作用也不容忽視,包括脫發、骨髓抑制、損傷卵巢功能等。本實驗以PM(環磷酰胺的體外活性成分)處理GC建立化療損傷性GC模型,并嘗試將TC與GC共培養發現:自噬啟動因子Beclin-1、微管結合蛋白輕鏈3(LC3B)、凋亡蛋白Bax、Caspase-3在PM作用的GC中,較對照組在轉錄水平及翻譯水平上有高表達,10%左歸丸含藥血清處理及與TC共培養處理可下調上述蛋白在模型組中的表達;然而自噬受體蛋白p62的表達較對照組降低,與TC共培養或在培養基中加入10%左歸丸含藥血清可上調模型組GC中p62蛋白及其對應mRNA的表達。且當GC與TC共培養處理的同時加入10%左歸丸含藥血清后上述蛋白及其對應的mRNA的表達變化程度更明顯。

自噬是一種溶酶體依賴的細胞內降解系統,在多種生理過程中起著重要的作用,在心血管疾病、腫瘤等各類疾病的發生發展中存在失衡狀態[10-11]。Beclin-1是自噬啟動關鍵因子;LC3B則是自噬過程的標志物,主要參與了自噬小體的形成;p62可在自噬時降解,能反映自噬的強弱。當LC3B升高,p62同時降低,則表明自噬流通暢[12-13]。凋亡是一種自主調節的細胞死亡過程,其特征是細胞收縮、膜泡出現、DNA斷裂和凋亡小體的形成,主要有2種途徑:外源性或死亡受體途徑、內源性或線粒體途徑。這2條通路最終都通過由Caspase-3的裂解啟動的執行通路。同時Bax蛋白不僅能作為Caspase-3的上游調控機制,調節其活性,也能作為Caspase-3的底物,在其下游機制發揮促凋亡作用,兩者相互聯系又相互制約,都是重要的促凋亡基因[14]。自噬和凋亡都是典型的程序性細胞死亡類型,通常發生在同一個細胞內。自噬的順序先于凋亡,自噬是否誘導或抑制凋亡取決于細胞類型、刺激性質和持續時間[15]。本實驗結果中模型組Beclin-1、LC3B基因表達上升的同時,p62基因表達下降,說明PM損傷GC過程中自噬流通暢,此過程中Bax和Caspase-3基因表達的上升也提示GC凋亡。

TC位于GC的周圍,源于卵巢的基質細胞,內含大量脂類物質和滑面內質網并存在豐富的LH受體。既往研究提示其不僅為卵泡提供結構支持,所分泌的雄激素也是GC合成雌激素的原料[16]:在TC產生大量雄激素及其誘導的芳香化酶活化的前提下,卵泡刺激素和黃體生成素相互協調,才可產生雌激素的爆發,同時OC即將完成第一次減數分裂,完成優勢卵泡最后階段的發育。此外TC還可分泌各種生長因子調控卵巢閉鎖過程[17],對抗GC凋亡,但關于TC對化療損傷性GC的影響及其具體機制的相關研究甚少。本實驗證明TC能緩解PM作用于GC引起的化療性損傷,且與左歸丸含藥血清有協同作用。PM對GC的損傷以及左歸丸含藥血清和TC對GC的保護作用中都存在自噬與凋亡現象,且可能存在“自噬-凋亡”交叉對話,補充了TC對GC又一作用以及左歸丸治療化療性POF的作用機制。但關于左歸丸含藥血清與TC共培養協同作用的具體機制、左歸丸含藥血清和TC通過哪些作用位點影響GC的自噬與凋亡過程,GC與TC之間是否還有其他相互作用等問題仍待下一步實驗闡明。