ABSL-3實驗室中恒河猴飼養的微生物風險控制

梁 燕,劉龍丁,楊夢莉,李敬美,郭 磊,李 恒,鄭惠文,李 菁,施海晶

(中國醫學科學院醫學生物學研究所,昆明 650118)

近年來,埃博拉、尼帕、高致病性禽流感等疾病的爆發與蔓延,進一步引起了全世界衛生組織的高度重視和公眾的廣泛關注[1-3]。尤其新型冠狀病毒肺炎更是受到了世界各國和世界衛生組織的高度重視[4]。為了研究這些致病性強、傳染性高、目前尚無特異性預防和治療的傳染病的控制措施,許多國家先后建立了高等級生物安全實驗室(BSL3/4實驗室)和高等級動物生物安全實驗室(ABSL3/4實驗室)[5-8]。BSL3/4實驗室和ABSL3/4實驗室在設計原則上基本一致,但由于動物實驗的特殊性及其具有更高的風險性,使得ABSL3/4實驗室在防護要求上更高于BSL3/4實驗室。研究人員需經嚴格生物安全實驗室操作規范培訓,熟悉ABSL-3/4實驗室操作及緊急事故處理辦法,才能真正降低生物安全隱患,杜絕生物安全事故的發生[9-10]。

ABSL-3/4實驗室內飼養的實驗動物為人工感染致死性或烈性感染性病原微生物的實驗動物,其中,恒河猴由于其體型較大、動作敏捷、攻擊性強、容易抓傷咬傷工作人員,從而給在ABSL-3/4實驗室中恒河猴實驗帶來了極高的生物安全風險[11]。除此之外,實驗過程中每日產生的飼養廢棄物這個易被忽略的環節亦隱藏著極大的生物安全隱患。一般來說,恒河猴生物安全籠具是通過密封、負壓、單向氣流等措施來保證人和環境的安全。恒河猴每日均產生排泄物,但這些帶有感染性病原微生物的排泄物極其可能通過氣溶膠傳播的方式給實驗人員和環境帶來極大的風險。因而,本文結合中國醫學科學院醫學生物學研究所大動物生物安全實驗室的恒河猴飼養實驗,以指示微生物對飼養過程中排泄物及沖洗過程所產生的浮游菌氣溶膠進行模擬檢測,同時對按照標準操作規程處理后的浮游菌進行檢測,以資對ABSL-3實驗室中恒河猴飼養廢棄物的清潔消毒處理操作有效性進行評價分析。

研究選用芽孢桿菌為指示微生物,采用便攜式浮游菌采樣儀分別對靜止狀態下、活動(飼養)狀態下、以及指示菌感染狀態下是否按照SOP進行清潔消毒處理的猴籠地面及沖洗排水口處進行浮游菌采集及檢測,從而對ABSL-3中恒河猴動物實驗室的飼養及清潔標準操作規程的有效性進行評估及分析,以保證最大程度降低ABSL-3實驗室中恒河猴動物實驗的生物安全風險。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性恒河猴2只,1～2歲,體重2.5～3 kg,來源于中國醫學科學院醫學生物學研究所醫學靈長類研究中心[SCXK(滇)K2017-0002],飼養于中國醫學科學院醫學生物學研究所[SYXK(滇)K2015-0006]。實驗內容經本單位動物實驗倫理審查委員會審查通過(DWSP201804006),實驗過程按實驗動物使用的3R原則給予實驗動物人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

細菌培養皿(sartorius stedim caso Agar TSA Agar BACTairTM,lot846106);酵母培養皿(sartorius stedim sabouraud Agar BACTairTM,lot846304);膜收集 皿(sartoriusstedim Gelatinepisposables,批 號846106);芽孢桿菌(Bacillus arophaeusATCC9372,Microbiologics,批號0953P);細胞周期試劑盒(Cell cycle staining kit(Multisciences),批號70-CCS012);細菌基因組DNA提取試劑盒(天根,批號DP302)。Airport MD8便攜式浮游菌采樣儀(德國賽多利斯公司);流式細胞儀CYTOFLEX(美國貝克曼公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物飼養

動物飼養于中國醫學科學院醫學生物學研究所ABSL-3實驗室恒河猴籠具中,該實驗室符合國標《實驗室生物安全通用要求》(GB19489—2008)和世界衛生組織《實驗室生物安全手冊》的要求。恒河猴籠具為開放式猴籠(見圖1),采用雙層設計,內層含直飲水噴嘴,外層門為鎖扣式,配有方便裝卸的飼料盒,籠具下層設置托盤用于收納猴排泄物及廢棄物。籠具及托盤后方連接排水口,排水口近端放置一次性金屬濾籃,用于收集可能導致堵塞的大顆粒排泄物。恒河猴每日早晚各喂食1次,并采用沖洗裝置每日沖洗籠具。

圖1 恒河猴籠具Figure1 Cage of rhesus monkeys

1.3.2 ABSL3實驗室恒河猴飼養及清潔SOP及未遵循SOP的操作方法比較

根據《實驗室生物安全通用要求》(GB19489—2008)的規定,同時結合本ABSL3實驗室猴籠裝置具體情況,制定了符合要求的ABSL3實驗室恒河猴飼養及清潔SOP。

(1)猴籠地面鋪置吸水墊:每日于猴籠地面鋪置吸水墊,長度環繞猴籠1周,寬度約40cm,以防止飼料或排泄物直接掉落于地面上。

(2)排泄物處置:如地面吸水墊上掉落實驗猴排泄物,取吸水紙覆蓋于排泄物上,在吸水紙上傾倒足量84消毒液原液,靜置10min后,將吸水墊卷曲包裹吸水紙,棄至廢棄物收集桶,并鋪置新的吸水墊。

(3)采用ABSL-3實驗室沖洗裝置每日清水沖洗猴籠1次,水量調至中檔,輕柔沖洗,以所有排泄物全部沖凈至排水口濾籃處為準。

(4)排水口濾籃內截留了沖洗的固體排泄物,傾倒足量84消毒液原液于排泄物上,靜置10min后,輕取濾籃置于垃圾袋中,棄至廢棄物收集桶。

為驗證嚴格執行SOP對ABSL3實驗室恒河猴飼養的微生物風險控制效果,特與未遵循SOP的操作方法進行列表對比,見表1。

表1 嚴格執行SOP與未遵循SOP的操作方法比較Table1 Comparison of operation methods between strictly following the SOP and not following the SOP

1.3.3 采樣方案設計

共4個采集狀態(見表2)。第1個采集狀態為靜止狀態下采樣;第2個為動態(飼養)狀態下采樣;第3個和第4個狀態均在使用芽孢桿菌為指示微生物的狀態下,將芽孢桿菌107spores/mL分別滴至猴籠地面排泄物及沖水時排水口濾籃內的排泄物,其中采樣狀態3為未嚴格按照飼養及清潔標準操作規程進行的狀態;采樣狀態4為嚴格按照標準操作規程處理后采樣。

表2 采樣狀態表Table2 Sampling time and state

每個采集狀態的采樣均于不同時間點重復3次,最后取平均值進行菌落計數。

1.3.4 采樣方法

采用賽多利斯Airport MD8便攜式浮游菌采樣儀采集環境中的浮游菌(見圖2),使用方法詳見說明書,每次采集1000L。分別內置細菌培養皿、酵母培養皿和膜收集皿。其中,采集后細菌培養皿置30℃～35℃培養3～5d,酵母培養皿置20℃～25℃培養3～5d,后進行菌落計數;膜收集皿則在采樣完成后,將膜取出,用30mL PBS溶解,4℃過夜,后2000 r/min離心棄沉淀,上清采用50000分子量超速離心管3000r/min離心濃縮至終體積1mL。

圖2 賽多利斯Airport MD8便攜式浮游菌采樣儀Figure2 Sartorius portable plankton sampler(Airport MD8)

1.3.5 氣溶膠活細胞檢測

取濃縮的濾膜溶液,采用細胞周期試劑盒染色,具體操作參照說明書進行:100μL濃縮濾膜液,加 入1mL DNA staining solution,及10μL permeabization solution,混勻,室溫孵育30min后,流式細胞儀上機檢測。

1.3.6 浮游菌PCR檢測

采用細菌組DNA提取試劑盒提取濃縮濾膜液的細菌DNA,引物序列(27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,338R:5’-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’),使用ExTaq(TaKaRa)進行PCR擴增,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 統計學方法

利用SPSS統計學軟件,對數據計算均值,以平均數±標準差(±s)進行相關數據分析。

2 結果

2.1 靜止狀態下的氣溶膠檢測

在靜止狀態下,分別對動物室門入口處及猴籠地面進行浮游菌采集,流式細胞儀結果顯示在未進行飼養活動的狀態下,動物室門入口及猴籠地面的活性顆粒物均較少,其中,門入口處略高;重復培養結果顯示,靜止狀態下有＜5個細菌生長,但無酵母生長;同時在入口及地面的細菌DNA檢測也驗證了上述結果。(見圖3)

圖3 ABSL-3實驗室靜止狀態下猴籠地面及動物室門入口處微生物檢測分析Figure3 Detection and analysis of microorganism in ABSL-3laboratory raised in the floor of the monkey cage and at the entrance of the animal chamber under the stationary state

2.2 常規活動狀態下的氣溶膠檢測

對飼養時猴籠地面進行浮游菌采集,流式細胞儀結果顯示活性顆粒較靜止狀態略有升高,同時細菌培養計數達約30個/皿,酵母生長數均為1個/皿。而在沖洗猴籠時,排水口濾籃處的浮游菌活性顆粒明顯增加,同時,細菌計數＞300個/皿,伴有＞10個/皿酵母生長。(見圖4)

圖4 ABSL-3實驗室活動狀態下猴籠地面飼養廢棄物及沖洗時排水口濾籃處廢棄物微生物檢測分析Figure4 Microbial detection and analysis of the waste in ABSL-3laboratory raised on the ground of the monkey cage under the active condition and the waste at the filter basket of the drainage outlet during water flushing

2.3 采用芽孢桿菌指示菌后未按照或嚴格按照SOP操作的氣溶膠檢測

在人工將107spores/mL的芽孢桿菌分別滴至猴籠地面上的排泄物及沖洗時排水口濾籃內的排泄物時,首先對未按照SOP進行消毒處理的猴籠地面排泄物及沖洗時排水口濾籃內的排泄物進行浮游菌采集,流式細胞儀結果表明氣溶膠顆粒明顯上升,同時細菌培養及細菌核酸檢測均有大量細菌生長,并伴隨酵母生長。而當我們嚴格按照飼養及清潔SOP程序對猴籠地面排泄物及沖洗時排水口濾籃內的排泄物進行處理后,結果顯示氣溶膠顆粒大大降低,同時細菌及酵母生長明顯減少,且在飼養過程中的猴籠地面排泄物中沒有檢測到細菌DNA。(見圖5)

圖5 ABSL-3實驗室活動狀態下未按照SOP和嚴格執行SOP猴籠地面飼養廢棄物及沖洗時排水口濾籃處廢棄物微生物檢測分析Figure5 Microbial detection and analysis of waste in ABSL-3laboratory raised on the ground of the monkey cage and at the filter basket of the drain outlet during flushing under the active state without following SOP or strictly following SOP

3 討論

高致病性微生物所致的烈性傳染病給人類的健康和生活帶來了極大的危害,研究預防和治療這些疾病的疫苗、藥物是戰勝疾病的重要手段,因而開展相應的動物實驗就顯得尤為重要了。其中,恒河猴因其與人緣關系較近,作為眾多高致病性微生物最適宜的易感動物,成為了ABSL-3實驗室中重要的實驗動物模型之一。在ABSL-3實驗室所進行的恒河猴實驗中,存在著較多的生物安全隱患[12],除動物逃逸、抓咬、注射以及樣本采集和解剖等諸如此類因實驗操作可能帶來的生物安全風險外,最容易被忽略卻又易可能導致較高風險的莫過于常規飼養過程中產生的排泄物通過氣溶膠的方式而對人或環境所造成的高致病性微生物傳播,因而對ABSL-3實驗室中恒河猴動物排泄物的清潔處理能否真正起到消除病原微生物傳播風險的評估就具有更加突出的意義了。

通過對靜止狀態下ABSL-3實驗室中恒河猴動物實驗室的浮游菌采集檢測結果分析可見,在無活動操作的情況下,無論是門入口處,還是猴籠地面,浮游菌檢測均在可控范圍之內,這個結果充分說明了整個實驗室設施的負壓狀態可以保證將污染物有效控制在猴籠屏障設施內。而在活動狀態下,也就是飼養狀態時,隨著恒河猴排泄物的出現,猴籠地面浮游菌檢測呈現陽性,尤其是在進行猴籠清潔沖洗時,排水口濾籃處的浮游菌數量大幅度增加,并伴隨酵母生長,這也充分說明了恒河猴飼養過程中產生的浮游菌及氣溶膠確實為動物實驗中一個非常重要的生物安全風險點,因而如何處理恒河猴排泄物以及這個處理是否行之有效就成為了恒河猴飼養及清潔操作規程的重要評價指標了。

因而,我們進行了重復對比試驗來驗證嚴格遵循執行恒河猴飼養及清潔操作規程是否能夠真正有效控制通過排泄物導致的病原傳播風險。對比試驗結果顯示,嚴格按照SOP操作較未遵循SOP而言,氣溶膠顆粒大幅度降低,細菌及酵母生長明顯減少,且在吸水墊上未檢測到細菌DNA,這個結果充分說明:首先,猴籠地面吸水墊的鋪置可以將排泄物控制在一個較小的區域范圍內,因而可以有效降低氣溶膠的產生;其次,足量84消毒液原液的處理也是降低病原微生物氣溶膠的有效手段。

氣溶膠微粒為直接大約0.05～500mm的極小分子分泌物,作為極分散的小微粒,它可攜帶病原微生物通過吸入的方式傳播給人和環境。正因為如此,ABSL-3實驗室內可能存在的氣溶膠傳播引起了越來越多的關注[13],越來越多的研究者們認為氣溶膠的傳播已經成為人類病原微生物傳播方式的頭號殺手,并致力于ABSL-3實驗室內氣溶膠感染動物模型的研究[14-15]。本研究將關注點置于ABSL-3實驗室恒河猴飼養過程中產生的排泄物可能導致的氣溶膠污染,提出了ABSL-3實驗室中恒河猴飼養及清潔的標準操作規程,并通過指示微生物的采樣對比實驗驗證了嚴格執行標準操作規程在控制實驗動物排泄物傳播風險點的有效性。