白鮮皮中3 種檸檬苦素化合物抗松材線蟲作用研究

于金英，高逸，孔振，汪冶

（1.麗水學(xué)院，浙江 麗水 323000；2.浙江理工大學(xué)，浙江 杭州 310018；3.麗水市蓮都區(qū)森林病蟲防治檢疫站，浙江 麗水 323000）

松樹萎蔫病（Pine wilt disease）即松材線蟲病，是由松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus引起的具有毀滅性的森林病害。松材線蟲屬我國(guó)重大外來入侵物種，同時(shí)也是世界性的檢疫害蟲[1]。阿維菌素是目前防治松材線蟲病應(yīng)用最為廣泛的生物藥，在果樹、蔬菜、糧食種植過程中也可使用該類藥物防治蟲害。但是該類藥物在環(huán)境污染方面存在一定的影響，所以找到一種防治效果好同時(shí)對(duì)環(huán)境沒有影響的藥物迫在眉睫，同時(shí)，由于長(zhǎng)期的單一使用，許多害蟲對(duì)阿維菌素類殺蟲劑已產(chǎn)生不同程度的抗藥性。因此，從生物源中尋找新的、對(duì)環(huán)境安全的殺線蟲活性物質(zhì)或先導(dǎo)化合物，并開發(fā)成線蟲防治劑是一項(xiàng)緊迫的任務(wù)。

檸檬苦素類化合物（Limonoids）是來源于楝科Meliaceae、蕓香科Rutaceae 和苦木科Simaroubaceae 植物的一類高含氧的三萜類次生代謝產(chǎn)物，檸檬苦素類化合物已被證實(shí)具有抗癌、抗菌、抗炎、昆蟲拒食等生物活性，并作為高效低毒生物農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用[2-3]。如來源于楝科植物印楝Azadirachta i ndica的印楝素（Azadirachtin）是目前世界上公認(rèn)的廣譜、高效、低毒、易降解、無殘留的殺蟲劑[4-5]；白鮮皮為蕓香科白鮮屬Dictamnus植物白鮮Dictamnus dasycarpus的干燥根皮，是常用中藥，其味苦，性寒，具有祛風(fēng)除濕，清熱解毒，殺蟲止癢等功效[6]。白鮮皮主要含有生物堿、檸檬苦素類化合物（梣酮、黃柏酮、吳茱萸內(nèi)酯）（如圖1）等化學(xué)成分，目前尚未見白鮮皮中檸檬苦素類化合物對(duì)松材線蟲影響的報(bào)道。為此，本研究在對(duì)白鮮皮中3 種主要檸檬苦素類化合物（梣酮、黃柏酮、吳茱萸內(nèi)酯）分離鑒定的基礎(chǔ)上，采用浸漬法開展梣酮、黃柏酮、吳茱萸內(nèi)酯毒殺松材線蟲的研究，并對(duì)白鮮皮中檸檬素類化合物抗松材線蟲效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

圖1 白鮮皮中3 種主要檸檬苦素類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu) Figure 1 Chemical structure of three limonoids from bark of D.dasycarpus

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品 實(shí)驗(yàn)用白鮮皮購于安徽亳州中藥材市場(chǎng)，梣酮、黃柏酮、吳茱萸內(nèi)酯3 種檸檬苦素化合物為麗水學(xué)院天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室從白鮮皮中分離制備。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株 實(shí)驗(yàn)所用灰葡萄孢Botrytis cinerea菌株為本實(shí)驗(yàn)室分離和保存。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)蟲株 實(shí)驗(yàn)所用松材線蟲為本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.4 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）采用馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL 自制馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。具體操作步驟為：將馬鈴薯去皮切塊放入鍋中，加入適量蒸餾水并加熱至沸騰，維持20～ 30 min，經(jīng)四層紗布過濾去除濾渣，在馬鈴薯過濾液中加入葡萄糖和瓊脂，加熱待瓊脂融化后，加蒸餾水至1 000 mL，121℃滅菌20 min。

1.1.5 M9 Buffer 自制M9 Buffer。具體操作步驟為：取KH2PO43 g、Na2HPO46 g、NaCl 5g、MgSO40.12 g，加蒸餾水至1 000 mL，121℃滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 檸檬苦素類化合物制備 稱取白鮮皮藥材10.0 kg，用6 倍量乙酸乙酯回流提取3 次，每次1 h，減壓濃縮，得到浸膏600 g，進(jìn)行硅膠柱色譜（200-300 目）分離，用石油醚-乙酸乙酯（100∶1）～（1∶1）梯度洗脫，每份收集500 mL，洗脫液經(jīng)薄層色譜檢識(shí)、合并。其中，F(xiàn)r.37-43 析出大量結(jié)晶狀固體，經(jīng)乙酸乙酯重結(jié)晶，得到化合物1（1.52 g）；Fr.85-95 在洗脫過程中有晶體析出，用丙酮重結(jié)晶，分別得到化合物2（1.04 g）和化合物3（0.67 g）。

1.2.2 松材線蟲培養(yǎng) 將灰葡萄孢菌株接種于PDA 培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基表面長(zhǎng)滿灰葡萄孢的菌絲時(shí)備用。

1.2.3 檸檬苦素類化合物對(duì)松材線蟲的毒殺作用 采用浸漬法測(cè)定檸檬苦素類化合物的殺線蟲活性。將3 種檸檬苦素類化合物分別用1% DMSO 溶解，分別配制為5.5、11.1、16.6、22.2、33.3 μg·mL-15 種濃度，取24 孔板加入100 μL 的松材線蟲液（30 條左右），再加入各濃度樣品溶液900 μL，使化合物溶液的終濃度分別為5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 μg·mL-1（組1、組2、組3、組4、組5）。以1% DMSO 作為空白對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，分別于處理24 h、48 h、72 h 時(shí)在體視顯微鏡下觀察松材線蟲的存活情況，蟲體運(yùn)動(dòng)呈“S”形、卷曲形、螺旋形者均判斷為活蟲；蟲體不運(yùn)動(dòng)且呈“J”形或“C”形，或者蟲體僵直、體壁無折光性則判為死蟲[7]。按以下公式計(jì)算松材線蟲的死亡率和校正死亡率：

1.3 數(shù)據(jù)分析

生物活性測(cè)定結(jié)果采用xˉ±s表示，采用Graphpad Prism 8.0 非線性擬合計(jì)算LC50值。按照Chandravadana的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[8]對(duì)殺線蟲活性強(qiáng)弱進(jìn)行分級(jí)：“－”表示校正死亡率≤10%，無殺線蟲活性；“＋”表示校正死亡率為＞10%～ 30%，殺線蟲活性弱；“＋＋”表示校正死亡率為＞30%～ 50%，殺線蟲活性中等；“＋＋＋”表示校正死亡率為 ＞50%～ 80%，殺線蟲活性較強(qiáng)；“＋＋＋＋”表示校正死亡率＞80%，殺線蟲活性強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬苦素類化合物結(jié)構(gòu)的鑒定

化合物1：無色棱柱狀晶體（乙酸乙酯），5%硫酸乙醇溶液顯色為墨綠色。C14H16O3，EI-MS m/z：232[M]+.1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：0.86（3H，s，CH3-9），2.14（3H，s，CH3-8），4.88（1H，s，H-3），6.35（1H，d，J=0.8 Hz，H-4’），7.44（1H，d，J=1.6Hz，H-5’），7.48（1H，s，H-2’）.13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：170.4（C-1），84.3（C-3），43.8（C-3a），20.9（C-4），32.0（C-5），32.8（C-6），149.3（C-7），128.3（C-7a），140.5（C-2’），121.0（C-3’），109.4（C-4’），144.8（C-5’），19.4（C-9），18.9（C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的梣酮一致，確認(rèn)化合物1 為梣酮。

化合物2 ：無色方晶（丙酮），5%磷鉬酸乙醇溶液顯藍(lán)色。C26H30O7，EI-MS m/z：454[M]+.1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：1.13，1.25，1.46，1.48，1.48（5×-CH3），1.51（6H，s，H-24，25），2.99（1H，t，H-5），3.65（1H，s，H-15），5.47（1H，s，H-17），5.98（1H，d，J=11.6Hz，H-2），6.37（1H，d，H-22），6.53（1H，d，J=11.6Hz，H-1），7.41（1H，t，H-23），7.43（1H，d，H-21）.13C-NMR（CDCl3，100MHz）δ:158.2（C-1），123.0（C-2），167.0（C-3），83.9（C-4），57.1（C-5），41.1（C-6），208.9（C-7），52.9（C-8），49.4（C-9），44.3（C-10），18.1（C-11），32.7（C-12），38.5（C-13），66.6（C-14），54.5（C-15），167.0（C-16），78.3（C-17），120.9（C-20），142.6（C-21），110.5（C-22），139.8（C-23），32.1,，27.4，21.4，20.5，16.2（5×-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道的黃柏酮一致，確認(rèn)化合物2 為黃柏酮。

化合物3：無色針晶晶（丙酮），5%硫酸乙醇溶液顯黃棕色。C26H30O8，EI-MS m/z：470[M]+.1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：1.08，1.18，1.18，1.30（4×-CH3），1.52（1H，m，H-12），1.64（2H，s，H-11），2.22（1H，dd，J=3.2，14.4Hz，H-5），2.46（1H，dd，J=3.2，15.6Hz，H-6a），2.55（1H，dd，J=2.8，12.4Hz，H-9），2.67（1H，dd，J=1.2，16.4Hz，H-2a），2.86（1H，d，J=15.2Hz，H-6b），2.96（1H，dd，J=4.0，16.8Hz，H-6b），4.04（1H，s，H-15），4.45（1H，d，J=13.2Hz，H-19a），4.75（1H，d，J=13.2Hz，H-19b），5.47（1H,，s，H-17），6.34（1H，s，H-21），7.42（1H，t，H-23）.13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：79.4（C-1），36.5（C-2），169.7（C-3），81.0（C-4），60.3（C-5），37.1（C-6），207.1（C-7），49.9（C-8），48.3（C-9），46.5（C-10），19.1（C-11），30.3（C-12），38.3（C-13），67.2（C-14），55.1（C-15），167.6（C-16），78.2（C-17），20.3（C-18），66.2（C-19），121.1（C-20），142.1（C-21），110.5（C-22），143.8（C-23），30.1（C-28），21.6（C-29），17.9（C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的吳茱萸內(nèi)酯一致，確認(rèn)化合物3 為吳茱萸內(nèi)酯。

2.2 3 種檸檬苦素類化合物對(duì)松材線蟲的毒殺活性

采用浸漬法，將松材線蟲浸漬于不同濃度的梣酮、黃柏酮、吳茱萸內(nèi)酯給藥溶液中，在處理24、48 和72 h時(shí)分別觀察松材線蟲的存活情況，結(jié)果見表1。由表1 顯示，3 種檸檬苦素類化合物對(duì)松材線蟲的毒殺作用均隨著給藥濃度的增加而增強(qiáng)，并隨著處理時(shí)間的增加而增強(qiáng)。在處理24 h、48 h 時(shí)，3 種檸檬苦素類化合物對(duì)松材線蟲的校正死亡率均＜50%，毒殺作用均不明顯；隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)至72 h，3 種檸檬苦素類化合物均表現(xiàn)出較為明顯的毒殺松材線蟲作用，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，其中，梣酮在≥20 μg·mL-1時(shí)，毒殺松材線蟲的校正死亡率＞80%，殺線蟲活性強(qiáng)，而在梣酮為15 μg·mL-1、黃柏酮為≥20 μg·mL-1、吳茱萸內(nèi)酯為25 μg·mL-1時(shí)均表現(xiàn)為殺線蟲活性較強(qiáng)。

表1 3 種檸檬苦素類化合物對(duì)松材線蟲的毒殺活性Table 1 Toxic activity of three limonoids against B.xylophilus

2.3 半致死濃度LC50 值的計(jì)算

運(yùn)用Graphpad Prism 8.0 對(duì)松材線蟲暴露于3種檸檬苦素類化合物給藥溶液72 h 的死亡率數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分別得到其LC50值，結(jié)果如表2。由表2 結(jié)果顯示，梣酮、黃柏酮、吳茱萸內(nèi)酯對(duì)松材線蟲的毒殺活性的LC50值分別為9.78、15.99、17.91 μg·mL-1，表明梣酮對(duì)松材線蟲表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。

表2 3 種檸檬苦素類化合物殺松材線蟲作用的LC50值Table 2 LC50 of three limonoids against B.xylophilus

3 結(jié)論與討論

目前，關(guān)于白鮮皮殺蟲活性研究的報(bào)道主要有：白鮮皮提取物對(duì)亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis殺蟲活性[12-13]，白鮮堿和梣酮對(duì)倉儲(chǔ)害蟲的拒食作用[14]，梣酮對(duì)鱗翅目Lepidoptera 昆蟲的毒殺作用等[15]。但對(duì)白鮮皮提取物或化學(xué)成分抗松材線蟲的研究均未見報(bào)道，因此，本研究首次開展了白鮮皮中檸檬苦素類化合物毒殺松材線蟲實(shí)驗(yàn)。

白鮮皮中的梣酮、黃柏酮、吳茱萸內(nèi)酯在結(jié)構(gòu)分類上均屬于檸檬苦素類化合物，但梣酮屬于降解型檸檬苦素類化合物，黃柏酮、吳茱萸內(nèi)酯屬于高度氧化檸檬苦素，因此它們?cè)诙練⑺刹木€蟲活性上表現(xiàn)出一定的差異性，其中，梣酮在≥20 μg·mL-1時(shí)，毒殺松材線蟲的校正死亡率＞80%，殺線蟲活性強(qiáng)，值得進(jìn)一步深入研究。

檸檬苦素類化合物可通過多種途徑發(fā)揮抗蟲作用，如印楝素可通過作用于昆蟲內(nèi)分泌系統(tǒng)來影響昆蟲的正常發(fā)育過程，從而發(fā)揮殺蟲作用[16]。梣酮可通過觸殺或胃毒或拒食發(fā)揮抗蟲效果。本研究中梣酮、黃柏酮、吳茱萸內(nèi)酯3 種檸檬苦素類化合物通過何種作用機(jī)制毒殺松材線蟲仍需要進(jìn)一步深入探究。