4 種柏科植物揮發油對松材線蟲的室內毒力測定

張輝，徐端妙，林秀君，陳莉娟，劉浩凱

（1.浙江省景寧畬族自治縣生態林業發展中心，浙江 景寧 323500；2.浙江省景寧縣畬族自治縣自然資源和規劃局，浙江 景寧 323500）

松材線蟲Bursaphelenchus x ylophilus是世界范圍內的檢疫性害蟲。松材線蟲病是由松材線蟲引起的具有毀滅性的森林病害，具有危害高、傳染快、治理困難等特點，被稱為“松樹癌癥”[1]。針對松材線蟲病的防治，常規方法包括及時清理疫木、加強對媒介昆蟲松墨天牛Monochamus alternatus的防治、生物防治和化學防治等，其中，化學防治效果明顯，但對環境造成了污染，對生態系統造成了破壞，如抗松材線蟲的阿維菌素乳劑對水生生物和有益昆蟲具有毒副作用[2]。因此，松材線蟲的化學防治研究逐漸從高毒、高殘留向低毒、低殘留的綠色環保型方向發展。植物源殺蟲劑以其對環境污染小、害蟲較難產生抗藥性、選擇性強，對人、畜及天敵毒性低，開發和使用成本相對較低的優勢越來越受到人們的重視。天然植物產生各種次生代謝產物用于保護自身免受害蟲的取食為害和病原菌的侵染，包括各種植物寄生線蟲的為害。因此，一些植物的次生代謝產物可以直接用于線蟲防治或作為先導化合物開發利用，如苦參堿、苦豆堿對松材線蟲有抑制作用[3]，植物揮發油類是一類新型植物源殺蟲劑，具有多靶點作用、環境友好等特點，在植物保護中展現出很強的應用潛力，如青花椒Zanthoxylum schinifolium精油對松材線蟲具有顯著毒殺效果[4]。本研究從日本花柏Chamaecyparis pisifera、日本扁柏C.obtusa、細葉花柏C.pisifera‘Plumoso’ 和臺灣扁柏C.obtusevar.formosana4 種柏科Cupressaceae 植物提取揮發油，以松材線蟲為研究對象開展室內毒力測定，評價4 種柏科植物揮發油對松材線蟲的毒殺效果，為研究新型植物源殺線蟲劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料和菌株 植物材料來源于麗水市景寧畬族自治縣草魚塘森林公園的日本花柏、日本扁柏、細葉花柏和臺灣扁柏的枝葉。番茄灰葡萄孢Botrytis cinerea，購自北京北納創聯生物技術研究院。

1.1.2 培養基和緩沖溶液 自制馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：準備馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、MgSO41.5 g、KH2PO43 g、瓊脂20 g、水1 000 mL，首先，將馬鈴薯去皮切塊放入鍋中，加入適量蒸餾水加熱至沸騰，保持20～ 30 min，然后用四層紗布過濾，去除濾渣，再在濾液中加入葡萄糖、MgSO4、KH2PO4、瓊脂，加熱待瓊脂融化后，加蒸餾水至1 000 mL，121℃滅菌20 min。自制M9 緩沖溶液：稱取KH2PO43 g、Na2HPO46 g、NaCl 5 g、MgSO40.12 g，加蒸餾水至1 000 mL，121℃滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 柏科植物揮發油的制備 將新鮮采集的4 種柏科植物的枝條，剪去老枝和枯葉，將剩余嫩枝和葉洗凈、陰干、剪碎后備用。取處理好的柏樹枝葉500 g，置于植物精油提取裝置，按液料比1∶5 加入蒸餾水，水蒸氣蒸餾2 h，收集揮發油部分，加二氯甲烷萃取3 次，自然揮發二氯甲烷，以無水硫酸鈉進行干燥，得黃色透明油狀物即柏樹揮發油。4 種柏科植物按相同方法分別提取，得到各自的揮發油。

1.2.2 松材線蟲分離、鑒定 試驗所用馬尾松Pinus m assoniana松材線蟲病疫木由麗水市蓮都區大港頭森林防疫站提供。分別取疫木主干上、中、下3 個位置的5 cm 厚木圓盤，砍取木質部碎片，采用貝爾曼漏斗法分離松材線蟲，接種于長滿灰葡萄孢的PDA 培養基上，28℃培養3 d，可獲得大量混合齡線蟲。經形態學和分子生物學鑒定[5-6]確認為其松材線蟲。

形態學鑒定：用移液槍吸取線蟲懸液置于載玻片上，酒精燈上加熱3～ 5 s，然后加蓋玻片制成臨時玻片，置于顯微鏡下觀察雌蟲尾尖突、陰門蓋，雄蟲交合傘等形態，典型特征明顯，符合松材線蟲的鑒定特征。

分子生物學鑒定：提取線蟲DNA，選擇ITS 特異性引物，以DNA 為模板進行PCR 擴增和測序，登陸NCBI網站中進行BLAST 比對，與松材線蟲（GenBank 登錄號：MN2701176.1）的序列相似性為99.87%。

1.2.3 松材線蟲的同期化培養 為了獲得處于同一生長水平的實驗用松材線蟲，對大量混合齡松材線蟲進行同期化處理。用M9 緩沖溶液把混合蟲齡的線蟲從培養基上沖洗下來，4 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，同樣方法重復清洗沉淀一次，最后在1.5 mL EP 管內將松材線蟲定容至300 μL。然后加入700 μL 的裂解液，混合震蕩3 min，4 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，保留沉淀。沉淀用M9 緩沖溶液反復沖洗3 次。同期化處理使成蟲裂解死亡，獲得松材線蟲蟲卵。加入1 mL 無菌水配置含蟲卵的懸液，接種于新的灰葡萄孢中，28℃培養3 d，得到同期化松材線蟲。

1.2.4 柏科植物揮發油對松材線蟲的毒殺作用 采用浸漬法測定4 種柏科植物揮發油的殺松材線蟲活性。分別取4 種柏科植物的揮發油80、40、20、10、5 μL，加入9 mL 1%二甲亞砜（DMSO）溶解，形成不同濃度的揮發油，取48 孔板每孔加入100 μL 的松材線蟲液（含松材線蟲25～ 40 條），再加入900 μL 的各濃度揮發油，通過減重法求得各精油的質量，將濃度換算為mg·mL-1使得日本扁柏揮發油的終濃度梯度為7.55、3.78、3.89、0.94、0.47 mg·mL-1；日本花柏揮發油的終濃度梯度為7.31、3.65、1.82、0.91、0.46 mg·mL-1；臺灣扁柏揮發油的終濃度梯度為7.68、3.84、1.92、0.96、0.48 mg·mL-1；細葉花柏揮發油的終濃度梯度為7.28、3.64、1.82、0.91、0.45 mg·mL-1，分別于24、48、72 h 時在體視顯微鏡下觀察松材線蟲的存活情況。以1%二甲亞砜作為空白對照，每個濃度設置3 個平行實驗。蟲體運動呈“S”形、卷曲形或螺旋形者判為活蟲；蟲體不運動且呈“J”形或“C”形，或者蟲體僵直、體壁無折光性者判為死蟲。按以下公式計算松材線蟲的死亡率和校正死亡率：死亡率（%）＝（死蟲數/供試蟲數）×100%；校正死亡率（%）＝（處理組死亡率－對照組死亡率）/（1－對照組死亡率）×100%。

1.3 數據分析

按照Chandravadana 等的分級標準[7]對殺松材線蟲的活性強弱進行分級：“－”表示校正死亡率≤10%，無殺線蟲活性；“＋”表示校正死亡率為＞10%～ 30%，殺線蟲活性弱；“＋＋”表示校正死亡率為＞30%～ 50%，殺線蟲活性中等；“＋＋＋”表示校正死亡率為＞50%～ 80%，殺線蟲活性較強；“＋＋＋＋”表示校正死亡率＞80%，殺線蟲活性強。生物活性測定結果的平均數據均采用xˉ±s表示。

實驗數據采用Graphpad Prism 5.0 軟件進行統計分析、LC50以及方差計算。

2 結果與分析

2.1 4 種柏科植物揮發油對松材線蟲的毒殺活性

將松材線蟲置于不同給藥濃度的日本扁柏、日本花柏、臺灣扁柏、細葉花柏揮發油樣品溶液中，在浸漬24、48、72 h 時分別觀察松材線蟲的存活情況，結果見表1。由表1 可知，4 種柏科植物揮發油在浸漬24、48 h 時對松材線蟲的毒殺作用均不明顯，其校正死亡率均≤30%，隨著作用時間的進一步延長，在浸漬72 h 時均顯示出明顯的毒殺活性，部分處理的校正死亡率≥80%，并且呈現出隨著發酵液濃度的提高而增加的趨勢。根據校正死亡率進行方差分析，發現4 種柏木揮發油在72 h 與24 h、48 h 毒殺松材線蟲的校正死亡率存在顯著性差異（P＜0.05）。

表1 4 種柏科植物揮發油對松材線蟲的毒殺活性Table 1 Nematicidal activity of essential oil from four species of Cupressaceae against B.xylophilus.

2.2 半致死濃度LC50 的計算

運用Graphpad Prism 5.0 對不同處理組松材線蟲72 h時的死亡率進行擬合得到LC50，結果顯示（表5），日本花柏、日本扁柏、細葉花柏及臺灣扁柏4 種柏科植物揮發油在浸漬72 h 時對松材線蟲抑制的LC50分別為2.84、2.77、2.37、1.76 mg·mL-1，表明臺灣扁柏揮發油對松材線蟲的毒殺效果最好，隨后依次為細葉花柏、日本扁柏和日本花柏。

表2 4 種柏科植物揮發油對松材線蟲抑制的LC50Table 2 LC50 of the essential oil from four species of Cupressaceae

3 結論與討論

植物揮發油（精油）是存在于植物組織中的一類重要次生代謝產物，主要由分子量較小的單萜、倍半萜及其氧化物組成。植物揮發油作為一種新型植物源殺蟲劑在農業、林業害蟲綜合防治中發揮著重要作用[8-9]，具有作用方式多樣、作用機制新穎及對非靶標生物安全等特點，可以通過趨避、引誘、觸殺、熏蒸、拒食和抑制生長發育等多種途徑毒殺發揮抗蟲效果[10]，植物揮發油在溫室、倉儲害蟲防治方面具有重要的應用價值[11]。另外，植物揮發油在松材線蟲防治方面也展現出潛在的應用價值，如丁香Syzygium ar omaticum、百里香Thymus mongolicus等揮發油具有顯著的毒殺松材線蟲作用[12]；黃山木蘭Magnolia c ylindrica和香榧Torreya gr andis‘Merrillii’精油對松材線蟲具有較強的致死活性，其對松材線蟲的LC50分別為947.10 μL·L-1和960.47 μL·L-1[13]；劉昕超等發現臭常山Dichroa febrifuga和飛龍掌血Toddalia asiatica精油具有殺線蟲活性，這2 種精油對松材線蟲和南方根結線蟲Meloidogyne incognita的LC50在30～ 480 mg·mL-1[14]。

本實驗首次報道了日本扁柏、日本花柏、臺灣扁柏和細葉花柏4 種柏科植物揮發油對松材線蟲的影響。研究結果顯示，4 種柏科植物揮發油對松材線蟲均具有毒殺作用，呈現時間依賴性和濃度依賴性。4 種柏科植物揮發油對松材線蟲的毒殺作用也表現出一定的差異性，日本花柏、日本扁柏、細葉花柏及臺灣扁柏對松材線蟲的LC50分別為2.84 mg·mL-1、2.77 mg·mL-1、2.37 mg·mL-1和1.76 mg·mL-1，其中臺灣扁柏揮發油對松材線蟲的毒殺效果較好，這可能與其揮發油成分的組成和比例等有關。本研究結果顯示，柏科植物揮發油具有作為松材線蟲毒殺藥劑的開發潛力。柏科植物揮發油提取工藝簡單、成本低、產量大且天然環保，將柏科植物揮發油作為植物源殺蟲劑開發利用將產生良好的經濟效益和生態效益。