3 種花色類型滇黃精的遺傳關系研究

謝蕾，肖良俊，吳濤，李賢忠，蘇包順，劉志彤

（1.西南林業大學，云南 昆明 650224；2.云南省林業和草原科學院，云南 昆明 650201；3.大理市林韻生物科技開發有限責任 公司，云南 大理 671000；4.巍山彝族回族自治縣農業農村局園藝工作站，云南 大理 671000）

滇黃精Polygonatum kingianum又名云南黃精，在2020 年版《中華人民共和國藥典》中與黃精P.sibiricum、多花黃精P.cyrtonema一起作為中藥黃精的基源品種[1]。黃精具有抗衰老、抗腫瘤、降血糖、提高免疫力、改善記憶、防止老年癡呆等功能[2]。黃精屬Polygonatum植物全球約有60 種，分類十分困難，其中有的種分布范圍很廣、形態變異很大，先是歸于百合科Liliaceae[3]或更窄的鈴蘭科Convallariaceae[4]或是假葉樹科Ruscaceae[5]，最近又根據核基因和葉綠體DNA 片段的系統分類證據歸并到天門冬科Asparagaceae[6-8]。《中國植物志》中記載的黃精屬植物廣泛分布于北溫帶，我國有31 種，目前尚未進行全面研究，僅依據其表型差異和分布特征劃分為不同的“種”[3]。滇黃精部分分布在越南和緬甸，主產于中國的云南、四川、貴州、廣西等省（自治區）[9]。云南滇中、滇西北等地滇黃精產量較大，是滇黃精的重要分布區。

《云南植物志》中記載的滇黃精花被顏色類型有紫紅色、綠色、黃綠色和白色，并且以紫紅色和白色最為常見[10]。作者在大理州大理市挖色鎮進行滇黃精資源收集和擴繁過程中發現，花被白色類型的滇黃精資源種植區內出現白花帶紫斑類型的滇黃精，并對其進行收集擴繁。滇黃精花被顏色類型繁多且鑒定困難，新發現的白花帶紫斑類型具有花被白色和紫紅色的特征，查閱文獻和實地走訪并未找到相關記載，紫紅花、白花和白花帶紫斑3 種類型滇黃精的遺傳關系尚不清楚。

近年來，分子標記技術在黃精屬植物的種源鑒定、遺傳多樣性分析、親緣關系等方面的研究中得到了廣泛應用[11-14]。周曄等[15]運用ISSR 分子標記方法對黃精屬植物進行遺傳多樣性分析，篩選出可以有效辨別野生黃精、人工栽培黃精以及市面上黃精偽品的引物，還利用RAPD 手段對中藥黃精及主要摻偽品長梗黃精P.filipes進行鑒別，確保中藥使用的安全有效[16]。張家曾[17]通過對不同產地的黃精與多花黃精進行遺傳學的系統研究，獲得了用于鑒定不同品種黃精及其遺傳多樣性的psbA-trnH序列。此外，陳友吾等[18]基于轉錄組測序數據鑒別和分析多花黃精EST-SSR 位點，為多花黃精遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構建提供了大量有價值的候選標記。這些工作為滇黃精資源鑒定和遺傳多樣性研究提供了很好的補充手段，本研究基于ISSR 分子標記技術，以差異較大的花色為研究目標分析了滇黃精的遺傳關系，以期為滇黃精資源的遺傳多樣性研究和分類鑒別提供依據。

1 材料與方法

1.1 采樣地概況

采樣地點位于云南省大理州大理市挖色鎮，地處大理市中東部，地理坐標為100°27′80″ E，25°95′05″ N，海拔為2 400 m，年平均氣溫為15℃，年降水量為1 100 mm。土壤紅色，屬亞熱帶季風氣候，氣候溫和，常年無酷熱嚴寒，少風霜，四季如春。

1.2 試驗材料

2019 年7 月，試驗所需材料采自云南省大理市挖色鎮滇黃精種植基地本。白花滇黃精（P1）為認定良種‘林韻1 號’，白花帶紫斑滇黃精（P2）為新發現擴繁植株，紫紅花滇黃精（P3）為認定良種‘普洱1 號’，見圖1。將3 種不同花色類型滇黃精資源（P1、P2、P3）各采集16 個單株（編號分別為A1-A16、B1-B16、C1-C16）。取各植株的健康成熟葉片放入濾紙取樣袋中，置于裝有硅膠的收納盒中保存備用。

圖1 三種花色滇黃精照片Figure 1 P.kingianum with different flower color

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA 提取 采用新型植物基因組DNA 提取試劑盒DNAsecure Plant Kit（天根生化科技有限公司）提取滇黃精葉片的DNA。用產自美國Thermo Fisher Scientific 的ND 2000 檢測DNA 的含量和純度，用2%瓊脂糖凝膠檢測DNA 質量。將DNA 濃度調整至20～ 40 ng·μL-1，―20℃保存備用。

1.3.2 PCR 擴增及引物篩選 從96 條ISSR 引物中篩選出條帶清晰、重復性高的11 條引物（表1）。PCR 擴增反應體系總體積為20 μL，包括MIX 10 μL、Primer 4 μL、Template 0.5 μL、H2O 5.5 μL。ISSR-PCR 擴增程序為：94℃預變性2 min；94℃變性30 s；52℃退火30 s；72℃延伸30 s，40 個循環；最后72℃延伸5 min。擴增產物取8 μL，用DL 2000 作為Markers，用2%瓊脂糖凝膠在150 V 下電泳22 min，EB 染色后用凝膠成像分析儀拍照保存。

1.4 數據統計與分析

采用人工計帶法判讀電泳圖譜中的擴增產物，相同遷移位置上條帶有或無分別計為“1”和“0”，構成“0，1”矩陣。用POP-GENE 32 軟件計算多態性位點百分比（P）、觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、多樣性指數Shannon-Wiener 指數（H′）、基因多樣性指數Nei’s 指數（H）、遺傳相似系數（I）、Nei’s 遺傳距離（D）等遺傳參數；利用NTSYS-pc 2.10e 軟件的SAHN 程序進行UPGMA 聚類分析，通過Tree plot 模塊生成聚類圖。

2 結果與分析

2.1 ISSR 擴增結果及多態性分析

用11 條引物對3 種不同花色類型的48 份滇黃精樣品進行ISSR 標記，總共擴增出103條清晰條帶，其中多態性條帶有99 條（表1）。平均每個引物擴增出9 個多態位點，其中8 條ISSR 引物包括引物840、887、889、826、880、886、890 和810 的多態性比率達100%，平均多態百分數為96.1%。其中，用引物826 擴增得到的總條帶數量和多態性條帶數量都是最多的，均為16 條。用引物887 和889 擴增得到的總條帶數量最少，均為5 條。引物868 對48株滇黃精單株的ISSR-PCR 擴增結果見圖2。

表1 48 株滇黃精單株的ISSR 擴增結果Table 1 Results of 48 P.kingianum individuals amplified with ISSR primers

圖2 引物868 對48 株滇黃精單株的ISSR-PCR 擴增結果Figure 2 Amplification results of 48 P.kingianum individuals with the ISSR primer 868

2.2 遺傳關系

由表2 可知，基于ISSR 標記，3 種不同花色類型滇黃精多態位點百分率的變異范圍為54.4%～ 65.1%，平均為60.8%，其中，紫紅花滇黃精（P3）的多態位點百分率最小，白花滇黃精（P1）的最大。觀測等位基因數、有效等位基因數、Shannon-Wiener 指數的范圍分別為1.54～ 1.65 個、1.26～ 1.30 個和0.25～ 0.29，3 個不同花色類型滇黃精的平均Nei’s 指數為0.17，其中，白花滇黃精（P1）的Nei’s 指數相對較高，這表明白花滇黃精存在豐富的遺傳多樣性，變異水平較大，白花帶紫斑滇黃精（P2）的多態位點百分率介于白花滇黃精（P1）與紫紅花滇黃精（P3）之間。

表2 3 種不同花色類型滇黃精的遺傳關系Table 2 Genetic relationship of P.kingianum with three flower color

2.3 遺傳距離及聚類分析

由表3 可知，3 種不同花色類型滇黃精的遺傳一致度為0.89～ 0.91，均值為0.90；遺傳距離為0.10～ 0.12，平均遺傳距離為0.11，說明3 種花色類型滇黃精之間的遺傳差異不大，其中白花帶紫斑滇黃精（P2）和紫紅花滇黃精（P3）之間具有相對較小的遺傳距離（0.10）和最大的遺傳一致度（0.91）。利用UPGAM 聚類法對48 份滇黃精樣品進行分析，基于遺傳一致度構建遺傳聚類圖。當遺傳一致度為0.69 時，聚為三組——白花滇黃精（P1，A1-A16）、白花帶紫斑滇黃精（P2，B1-B16）和紫紅花滇黃精（P3，C1-C16）（圖3）。

表3 3 種不同花色類型滇黃精的遺傳一致度和遺傳距離Table 4 Genetic identity and genetic distance of P.kingianum with different flower color

圖3 基于遺傳一致度的UPMGA 聚類圖Figure 3 UPGMA dendrogram based on genetic identity

3 討論

本試驗采樣的3 種不同花色類型滇黃精均來自同一塊基地，它們的空間距離較近，自然條件下通過蟲媒等影響各花色類型之間的花粉傳播，加強了基因交流。故推測白花帶紫斑滇黃精可能是紫紅花滇黃精和白花滇黃精的過渡類型，或者是白花滇黃精和紫紅花滇黃精自然授粉后，所產生的子代的一種雜合狀態。由于滇黃精栽培歷史較短、地域性差異較大，對其植物學特征和生物學特性的研究尚不充分的原因，導致了對同一個物種的形態學、物候期等基本生物學特性描述不一致的現象[19]。紫紅花滇黃精（P3）為野外常見類型，分布范圍廣，也是目前人工馴化栽培面積最大的類型，其塊莖芽頭少，但芽頭大，須根多，產量低；白花滇黃精（P1）主要分布在云南大理、祿豐一帶，植株較紫紅花滇黃精矮小、抗性強、芽頭多、須根少、產量高；白花帶紫斑滇黃精（P2）為在大理州大理市挖色鎮進行滇黃精資源收集和擴繁過程中新發現的類型，植株表現在株型、塊莖等方面與白花滇黃精（P1）基本一致，目前，關于白花帶紫斑滇黃精的資料記載和報道較少。黃精屬種間甚至種內的形態特征有明顯的交錯過渡，其中不少種類在地理分布上存在重合，變異復雜，常伴有種間雜交現象，種與種之間的界限相當模糊，致使該屬的系統分類與種的鑒定不甚明確[20]。近年來，有通過生藥學鑒別[21-22]、花粉鑒別[23-24]、葉表皮及種皮鑒別[25-26]并通過細胞學[27-28]對黃精屬進行分類鑒別研究的報道，但這些傳統植物形態學分類方法并不能保證黃精屬鑒別分類的可靠性。

隨著分子生物學科研究的完善與深入，先后出現了多種基于DNA 水平的分子鑒定技術，這些技術加速了黃精屬相關領域的研究并取得了較為豐碩的成果。目前，ISSR 技術被廣泛應用于黃精屬種質資源的鑒定、遺傳多樣性及親緣關系分析、指紋圖譜構建[29]。多花黃精和長梗黃精P.filipes為福建省市場上常見的易混黃精屬植物，徐惠龍等[30]利用ISSR 分子標記技術對這兩種植物進行了種質資源鑒別，發現這兩種植物種質間分化差異較大，多花黃精種質與長梗黃精種質均能單獨聚為一類；楊青等[31]通過ISSR 分子標記方法對武夷山及周邊地區的五份黃精屬植物進行了有效區分；卜靜等[32]通過對野生居群玉竹P.odoratum與栽培居群玉竹的ISSR 分析比較發現，野生居群玉竹的遺傳多樣性高于栽培玉竹的，地理來源相同的野生居群與栽培居群親緣關系更加接近。以上研究表明ISSR 技術可為黃精屬種質鑒別提供新的方法與參考依據。本研究利用ISSR 分子標記對3 種花色類型滇黃精進行了遺傳關系研究。但采用ISSR 標記方法獲得的遺傳多樣性信息較為簡單，下一步將在分子標記的基礎上結合滇黃精的表型特征、藥用功效及品質評價對其進行深入研究，從而獲得的更為豐富的遺傳多樣性信息，為滇黃精的資源分類及良種選育奠定基礎。

4 結論

在滇黃精DNA 數據較為匱乏的限制條件下，利用ISSR 分子標記方法對3 種不同花色類型滇黃精的48 份樣品進行了遺傳關系研究。白花滇黃精（P1）的多樣性指數為0.19，相對白花帶紫斑滇黃精（P2）和紫紅花滇黃精（P3）這兩種類型較高。從多態性和遺傳聚類結果看，白花滇黃精（P1）、白花帶紫斑滇黃精（P2）與紫紅花滇黃精（P3）均可以很好地各自獨立聚為一組，其中白花帶紫斑滇黃精與紫紅花滇黃精的親緣關系相對更近。新發現的滇黃精類型增加了分類鑒別的難度，但其豐富的變異為選育優質、高產、抗逆的滇黃精新品種提供豐富的育種材料。