4種青蒿琥酯靶向線粒體化合物的合成及結構鑒定

賴 祺，呂 典，段云鳳，段文蘭，尹俊林，周永云

(云南民族大學 民族醫藥學院 民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室，云南 昆明 650500)

幾十年來，伴隨著疾病模式的改變和人口老齡化趨勢增加，我國對于癌癥的負擔逐年增加，癌癥防治已經面臨嚴峻形勢[1-2].屠呦呦團隊最先從植物黃花蒿中提取出了青蒿素，并用于治療瘧疾，獲得了極好的療效.除抗瘧疾作用外，青蒿素及其衍生物被發現對于抗腫瘤也具有較好的活性[3].

青蒿素及其衍生物都是具有過氧橋鍵(R-O-O-R′)的倍半萜化合物，這類化合物具有良好的抗腫瘤作用.其中青蒿琥酯對黑色素瘤、卵巢癌、大腸癌、前列腺癌、白血病和腎癌均有一定的抑制作用[4].雙氫青蒿素對于骨肉瘤、肺癌、白血病以及胰腺癌具有良好的抑制作用[5].

線粒體不僅是產生能量的細胞器，而且在眾多細胞過程中起著關鍵的作用[6].因為線粒體能夠產生活性氧(ROS)及相應氧化應激信號，因此線粒體與眾多疾病密切相關，包括癌癥[7]、糖尿病、阿爾茨海默癥[8]和其他神經退行性疾病.腫瘤細胞內線粒體異常豐富，并且線粒體在腫瘤細胞抗凋亡，促進腫瘤組織的生長中扮演著重要的角色[9].線粒體在合成ATP的時候需要從線粒體膜內向細胞質中泵出質子，從而產生電位差.以此電位差來驅動化學反應的進行，即ATP的合成.因此導致了線粒體膜電位很大(-150～-180 mV，內部為負電位)，質膜電位(-30～-60 mV 內部為負電位)[10-11].離域型親脂性陽離子(Delocalized Lipophilic Cation, DLC)是帶有離域正電荷的親脂性化合物，其能選擇性得被線粒體吸收，即靶向到線粒體.F16[12]為含有吲哚及吡啶鹽的DLC，其具有優異的線粒體靶向作用.小檗堿[13]也被研究發現具有靶向線粒體的作用，且本身也具有一定的抗腫瘤活性.

因此，文中選用F16、小檗紅堿、小檗堿衍生物以及硒醚連接子作為靶向分子結合青蒿琥酯，研究其合成方法.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

試劑均購買于薩恩化學技術(上海)有限公司，實驗所用試劑均為分析純.BrukerAvance 400、BrukerAvanceIII HD 600 型核磁共振儀; Agilent 6420 型質譜儀(ESI-MS).

1.2 青蒿琥酯靶向線粒體化合物的合成

1.2.1 F16的合成

1.2.2 F16-青蒿琥酯偶聯物的合成

圖1 F16-青蒿琥酯偶聯物的合成路徑

1.2.3 小檗紅堿的合成

圖2 小檗紅堿-青蒿琥酯偶聯物的合成路徑

1.2.4 小檗紅堿-青蒿琥酯偶聯物的合成

1.2.5 羥乙基小檗堿的合成

1.2.6 羥乙基小檗堿-青蒿琥酯偶聯物的合成

圖3 羥乙基小檗堿-青蒿琥酯偶聯物的合成路徑

1.2.7 硒醚連接子的合成

如圖4，LiBH4(81.68 mg)和NaOH(0.2 g)溶于 4 mL 超純水并置于冰中保存.8 eq 硒單質(2.37 g)和 6 eq NaOH(1.2 g)加入到 100 mL 二頸燒瓶中，再加入 15 mL 超純水，然后對裝置進行氮氣保護.在冰浴中，把LiBH4堿性水溶液緩慢注射進入硒單質堿性水溶液中.添加完成后置于室溫反應 1 h，然后加熱至 105 ℃ 反應 30 min，得棕紅色Na2Se2堿性水溶液.Na2Se2的反應液冷卻至室溫.期間，8.4 eq 3-氯丙酸(3.42 g)及 4 eq NaOH(600 mg)溶于超純水(8 mL)中.在氮氣保護下，3-氯丙酸堿性水溶液注射進Na2Se2堿性水溶液中，然后置于室溫反應 12 h.溶液顏色由棕色溶液緩慢變為淡黃色透明溶液.用濃鹽酸調節pH為2～3之間，產生大量黃色沉淀.使用循環水真空泵抽濾溶液，并用超純水洗滌3次，真空干燥箱干燥，得黃色固體化合物9.化合物9(500 mg)和 1.2 eq 的DL-二硫蘇糖醇(DTT，304.3 mg)迅速加入到 50 mL 二頸燒瓶中，并立即用氮氣保護，然后注射 10 mL 超純水進入反應容器中.3 eq 的NaOH(197.3 mg)溶于超純水中，再注射加入到反應容器中，置于室溫反應 2 h.另一份 2.5 eq NaOH(164.4 mg)及 3 eq N-Boc-3-氨基丙基溴溶于水/乙腈(V/V,1∶2、9 mL)混合溶劑中，然后加入到反應容器中.裝置放置室溫反應 12 h，溶液由淡黃色渾濁溶液變為為無色透明溶液.反應完成后，利用旋轉蒸發儀除去溶液中的乙腈.然后把溶液轉移到分液漏斗中用二氯甲烷萃取3次.萃取后的水相用1N鹽酸調節pH至3～4，然后用二氯甲烷萃取3次.合并有機相，并用無水硫酸鈉干燥.旋干溶劑后得到無色油狀液體.然后用硅膠柱層析，二氯甲烷/甲醇(V/V,50∶1)為洗脫劑，收集餾分、旋干溶劑后得到無色油狀化合物10，產率76%.1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ: 1.46(s, 9H, Me)，1.84(q, 2H,J=7.1 Hz,7-H)，2.61(t, 2H,J=7.3 Hz, 3-H)，2.78(q, 4H,J=3.1,2.7 Hz, 4-H2, 6-H2)，3.22(q, 2H,J=7.9,7.1 Hz, 8-H)，4.71(s, 1H, NH)；ESI-MS(m/z): 309.543[M-H]-(calcd for C11H20NO4Se-, 310.056).

1.2.8 F16-Se-青蒿琥酯偶聯物的合成

如圖4，F16-Se-青蒿琥酯的合成應首先縮合F16與硒醚化合物.2 eq 硒醚化合物10(44.8 mg)與 2.1 eq EDCl(29.1 mg)加入 10 mL 圓底燒瓶中，并加入 3 mL DCM溶解，置于室溫中反應 30 min.然后加入化合物5(25.9 mg)的甲醇溶液(2 mL)，并避光反應過夜.反應完成后移除溶劑，并加入二氯甲烷/甲基叔丁基醚(V/V,1∶3)20 mL 重結晶得化合物11，產率44%.然后把化合物11溶于50% TFA(DCM)溶液 10 mL 并反應 2 h.反應完成后除去大部分溶劑，再加入甲基叔丁基醚，抽濾溶液并用甲基叔丁基醚、乙酸乙酯各洗滌3次.干燥后即得F16硒醚化合物.F16硒醚化合物(33.8 mg)加入到 10 mL 圓底燒瓶中，并加入 1 mL 甲醇溶解.2 eq 青蒿琥酯(55.3 mg)與 2.1 eq EDCl(28.9 mg)加入另一 10 mL 圓底燒瓶中，加入 3 mL DCM反應 30 min.再把青蒿琥酯反應液加入到F16硒醚化合物溶液中，并避光處理，反應過夜.反應完成后使用甲基叔丁基醚/乙酸乙酯(V/V,1∶1)重結晶，然后通過葡聚糖凝膠純化得到黃色化合物12，產率18%.ESI-MS(m/z): 837.043[M+H]+(calcd for C43H57N4O8Se+, 837.334).

圖4 F16-青蒿琥酯偶聯物的合成路徑

2 結果與討論

2.1 F16-青蒿琥酯偶聯物

EDCl作為縮合劑有多種輔助試劑組合，并且青蒿琥酯以及F16衍生物的溶解度不同.青蒿琥酯易溶于各種有機溶劑難溶于水；F16衍生物幾乎只溶于水及甲醇，不溶于其他有機溶劑.因此選擇了二異丙基乙胺(DIPEA)作為堿，N-羥基-苯并三唑(HOBt)以及N-羥基馬來酰亞胺(NHS)作為活化劑，DCM、甲醇、乙腈作為溶劑篩選合成條件.因為添加了DIPEA以及活化劑并沒有很優異的效果，而且對于反應的后處理來說，增加了一定的難度.因此選擇無堿無活化劑的條件來合成.

表1 F16-青蒿琥酯縮合條件考察

2.2 小檗紅堿-青蒿琥酯偶聯物

在合成小檗紅堿和青蒿琥酯的偶聯物時發現，產物含量特別低.而且發現小檗紅堿的溶液中添加了質子酸后，溶液由紅色變為黃色.通過查閱文獻可知，小檗紅堿在酸性條件下羰基會互變異構成羥基.為此，在反應溶液中添加質子酸，能促進青蒿琥酯的羧基和小檗紅堿的羥基偶聯.

通過添加不同的酸和堿，產物的合成有明顯的不同.添加了DIPEA后幾乎沒有產物，因為堿抑制了小檗紅堿構型的轉化.當添加的酸為鹽酸的時候產生了大量的小檗紅堿沉淀，沉淀為黃色.沉淀的產生降低了小檗紅堿的濃度，進而減少了反應的進度.

表2 小檗紅堿-青蒿琥酯縮合條件考察

2.3 羥乙基小檗堿-青蒿琥酯偶聯物

小檗紅堿-青蒿琥酯偶聯物不穩定，放置一段時間后會自動分解成小檗紅堿和青蒿琥酯.因此對小檗紅堿進行修飾，使其能更加穩定.目標設計為對小檗紅堿的酚羥基進行烷基化，即對小檗堿進行碳鏈的延長，并增加能夠參與酰化反應的官能團.因此選擇了羥乙基作為修飾的基團.

表3 羥乙基小檗堿-青蒿琥酯縮合條件考察

羥乙基小檗堿在甲醇以及水中有一定的溶解度尤其是水和甲醇的混合溶液，但在其他有機溶劑中幾乎不溶.但是在進行酰化反應的時候甲醇會與青蒿琥酯反應，影響反應的產率.通過不同溶劑的組合，選擇DMF和DCM混合溶液作為反應溶劑能較好的得到羥乙基小檗堿與青蒿琥酯偶聯物.

3 結語

本論文基于線粒體的特異性選擇了F16、小檗紅堿、羥乙基小檗堿作為線粒體靶向分子，以青蒿琥酯偶聯線粒體靶向分子合成3種化合物，并且通過硒醚作為連接子合成F16與青蒿琥酯的偶聯物共4個化合物，并使用ESI-MS，1HNMR鑒定化合物的結構.通過對反應條件的篩選，F16在無酸堿添加，無HOBt、NHS等條件下，利用二氯甲烷和甲醇為溶劑，與青蒿琥酯偶聯副產物少、產率高.小檗紅堿則需要在TFA，DMAP，的催化下，才能順利與青蒿琥酯偶聯.羥乙基小檗堿由于其溶解度的問題，需要在DMF中才能順利完成反應.因此，為線粒體靶向青蒿琥酯衍生物的合成提供了可靠的合成方法，也為其他藥物靶向線粒體化合物的合成提供了一個最優的合成路徑.