miR-9介導HIF-1α通路對妊娠滋養細胞氧化應激損傷的影響

金良怡 尹智華

【摘要】 目的：探討miR-9介導缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）通路對妊娠滋養細胞氧化應激損傷的影響。方法：對數生長期的JEG-3細胞隨機分為對照組、miR-NC組與miR-9組，miR-NC組與miR-9組轉染終濃度為100 nmol/L的miR-NC與miR-9 mimics，對照組轉染等體積的磷酸鹽緩沖液。采用MTT法檢測細胞增殖，Annexin V/FITC檢測細胞凋亡，Transwell小室實驗檢測細胞侵襲，酶聯免疫法檢測氧化應激損傷指標，蛋白質印跡法檢測HIF-1α蛋白表達。結果：轉染后24、36 h，miR-9組細胞侵襲指數與細胞增殖指數均明顯較對照組與miR-NC組低（P<0.05），細胞凋亡指數均高于對照組與miR-NC組（P<0.05）。轉染后24、36 h，miR-9組的SOD含量均高于對照組與miR-NC組（P<0.05），MDA含量、HIF-1α蛋白相對表達水平均低于對照組與miR-NC組（P<0.05）。結論：miR-9在妊娠滋養細胞的高表達能抑制HIF-1α的表達，維持氧化應激處于平衡狀態，從而促進細胞凋亡，抑制細胞增殖與侵襲。

【關鍵詞】 miR-9 妊娠滋養細胞 缺氧誘導因子-1α 氧化應激 細胞凋亡 細胞增殖

Effects of miR-9-mediated HIF-1α Pathway on Oxidative Stress Damage of Gestational Trophoblasts/JIN Liangyi， YIN Zhihua. //Medical Innovation of China， 2022， 19（02）： 0-027

[Abstract] Objective： To investigate the effects of miR-9-mediated Hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α） pathway on the oxidative stress damage of gestational trophoblasts. Method： JEG-3 cells in logarithmic growth phase were randomly divided into three groups-control group， miR-NC group and miR-9 group， miR-NC group and miR-9 group were transfected with miR-NC and miR-9 mimics at final concentration of 100 nmol/L， the control group were transfected with equal volume of phosphate buffer. MTT method were used to detect cell proliferation， Annexin V/FITC were to detect cell apoptosis， Transwell chamber were to detect cell invasion， enzyme-linked immunoassay were to detect oxidative stress damage indicators， Western blotting were to detect HIF-1α protein expression. Result： At 24 h and 36 h after transfection， the cell proliferation index and cell invasion index of the miR-9 group were lower than those of the the control group and miR-NC group （P<0.05）， and the apoptosis index were higher than those of the the control group and miR-NC group （P<0.05）. At 24 h and 36 h after transfection， the SOD content of miR-9 group were higher than those of the control group and miR-NC group （P<0.05）， MDA content and relative expression levels of HIF-1α protein were lower than those of the control group and miR-NC group （P<0.05）. Conclusion： The high expression of miR-9 in gestational trophoblasts can inhibit the expression of HIF-1α， maintain oxidative stress in balanced state， promote cell apoptosis， inhibit cell proliferation and invasion.

[Key words] miR-9 Gestational trophoblast Hypoxia-inducible factor-1α Oxidative stress Apoptosis Cell proliferation

First-author’s address： Shenyang Women’s and Children’s Hospital， Shenyang 110011， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.02.006

胎盤是聯系胎兒和母體的紐帶，有免疫屏障、物質轉運、內分泌等多種功能。滋養細胞可參與人類胎盤的形成，能分泌一些血管舒縮物質、胎盤激素、酶和體液因子，通過旁分泌、自分泌等途徑調節著胎盤的血液循環[1]。妊娠滋養細胞的氧化應激損傷可參與對母體免疫損害或病原體入侵的監視活動，對胎兒-胎盤血管張力產生不良影響，也可影響該部位的血管滲透壓[2-3]。miRNA是內源性非編碼小分子RNA，能通過靶向調控mRNA的表達，從而參與調控機體細胞的生物學功能，對于滋養細胞的增殖、凋亡、生長等方面均有重要的調控作用[4]。miR-9被認為是一種能夠促進多種腫瘤發生發展的重要的原癌microRNA，能抑制心肌氧化損傷，促進心肌細胞增殖，也能促進腫瘤細胞增殖與腫瘤血管生成[5-6]。缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）是哺乳動物和人體內的核轉錄因子，可介導腫瘤細胞的運動與生長[7]。HIF-1α可參與調節細胞PI3K/AKT/FRAP途徑，從而調節細胞增殖與凋亡[8-9]。本文具體探討了miR-9介導HIF-1α通路對妊娠滋養細胞氧化應激損傷的影響，希望能夠揭示miR-9介導在妊娠滋養細胞的分子作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究在2018年1月-2020年12月進行。JEG-3絨毛膜癌細胞購自中國科學院上海細胞生物所，低糖DMEM培養液、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清購自美國Gibco公司，AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒購自美國BD公司，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術公司，Western blot檢測一抗購自美國Sigma公司，miR-9 mimics（模擬物）、miR-NC購自德國吉瑪公司、TRIzol提取試劑購自北京康為世紀生物科技公司、PCR檢測試劑盒購自上海雅吉生物公司，脂質體轉染試劑、MTT檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2 細胞分組與轉染 對數生長期的JEG-3細胞隨機分為對照組、miR-NC組與miR-9組，miR-NC組與miR-9組轉染終濃度為100 nmol/L的miR-NC與miR-9 mimics，對照組轉染等體積的磷酸鹽緩沖液，轉染后6 h進行換液培養。

1.3 MTT法檢測細胞增殖 取對數生長期細胞，培養24 h后進行轉染，轉染后培養24、36 h棄去上清，加入終濃度0.5 g/L MTT 100 μL，繼續培養4 h，將上清液棄除，加入150 μL DMSO后震蕩，時間為10 min，在490 nm下測定吸光度，從而計算細胞增殖指數。

1.4 Annexin V/FITC檢測細胞凋亡 采用胰酶消化細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用400 μL Annexin V/FITC結合液懸浮細胞，調整細胞濃度為1×109個/L。加入5 μL Annexin V/FITC染色液與10 μL PI染色液，避光孵育15 min，采用FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡指數。

1.5 細胞侵襲 取基質膠100 μL，將其均勻覆蓋于Transwell的小室底部，調整細胞濃度后加入至Transwell上室中，并在下室中加入培養基，之后行固定、染色，在顯微鏡下拍照、計數，計算細胞侵襲指數。

1.6 氧化應激損傷指標測定 收集細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重懸于0.5 mL緩沖液中，超聲破碎細胞，采用酶聯免疫法檢測上清SOD和MDA水平。

1.7 蛋白質印跡法檢測HIF-1α蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗（HIF-1α，1︰1 000;β-actin，1︰2 000）4 ℃孵育過夜，二抗（1︰2 000）室溫孵育1 h，加入化學發光增強試劑，曝光顯影后采用圖像分析系統進行分析。上述實驗都重復3次。

1.8 統計學處理 SPSS 23.00軟件，計量數據用（x±s）表示，兩兩對比為LSD-t檢驗，多組間使用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組轉染后不同時間點的細胞增殖指數對

比 轉染后24、36 h，三組細胞增殖指數比較，差異均有統計學意義（P<0.05）;轉染后24、36 h，miR-9組的細胞增殖指數均較對照組、miR-NC組低（P<0.05）。見表1。

2.2 三組轉染后不同時間點的細胞凋亡指數對

比 轉染后24、36 h，三組細胞凋亡指數比較，差異均有統計學意義（P<0.05）;轉染后24、36 h，miR-9組的細胞凋亡指數均高于對照組與miR-NC組（P<0.05）。見表2。

2.3 三組轉染后不同時間點的細胞侵襲指數對

比 轉染后24、36 h，三組細胞侵襲指數比較，差異均有統計學意義（P<0.05）;轉染后24、36 h，miR-9組的細胞侵襲指數均明顯較對照組與miR-NC組低（P<0.05）。見表3。

2.4 三組轉染后不同時間點的SOD和MDA含量對比 轉染后24、36 h，三組SOD和MDA比較，差異均有統計學意義（P<0.05）;轉染后24、36 h，miR-9組的SOD含量均明顯較對照組與miR-NC組高（P<0.05），MDA含量均低于對照組與miR-NC組（P<0.05）。見表4。

2.5 三組轉染后不同時間點的HIF-1α蛋白相對表達水平對比 轉染后24、36 h，三組HIF-1α蛋白相對表達水平比較，差異均有統計學意義（P<0.05）;轉染后24、36 h，miR-9組的HIF-1α蛋白相對表達水平均明顯較對照組與miR-NC組低（P<0.05）。見圖1與表5。

3 討論

胎兒-胎盤循環具有血流量大、缺少自主神經支配、低血流阻力等特點，主要靠血管活性物質來維持其循環狀態。當機體缺乏葡萄糖、脂質過度負荷、病毒感染、分泌蛋白合成增加等均可影響機體的氧化應激狀態，有可能導致應激損傷，從而誘發細胞功能受損疾病的發生[10-11]。miR-9在不同的組織部位具有不同的表達譜，在免疫反應、炎性反應、病毒感染等多種疾病中有重要作用。有研究認為miR-9能通過作用于不同靶向基因參與惡性腫瘤的發生及發展過程，miR-9可通過靶向下調促癌基因的編導，從而促進惡性腫瘤細胞的生長及侵襲[12-13]。本研究顯示轉染后24、36 h，miR-9組的細胞增殖、侵襲指數均低于對照組與miR-NC組（P<0.05），表明miR-9在妊娠滋養細胞的高表達能抑制細胞增殖與侵襲。

microRNA是由23個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA分子，可參與機體的多個生命過程中。胎盤作為母嬰物質交換界面的同時也是內分泌器官，可通過妊娠滋養細胞發生重要作用。miRNA與妊娠滋養行疾病的發生及發展顯著相關[14-15]。本研究顯示轉染后24、36 h，miR-9組的細胞凋亡指數均高于對照組與miR-NC組（P<0.05），表明miR-9在妊娠滋養細胞的高表達能促進細胞凋亡。

氧化應激在妊娠糖尿病與妊娠高血壓發病中發揮關鍵作用，和正常妊娠相比，妊娠糖尿病與妊娠高血壓孕婦的胎盤中抗氧化酶減少與脂質過氧化物增加[16]。正常情況下，機體內活性氧的產生和清除處于動態平衡狀態，內外在各種因素的刺激可導致活性氧大量生成，可超過抗氧化系統的清除能力，造成機出現氧化應激狀態，從而導致病理損傷[17]。本研究顯示轉染后24、36 h，miR-9組的SOD含量均高于對照組與miR-NC組（P<0.05），MDA含量均低于對照組與miR-NC組（P<0.05），表明miR-9在妊娠滋養細胞的高表達能改善氧化應激狀態。SOD是體內抗氧化防御系統的主要防線，SOD水平下降可誘發MDA的產生，而后者對細胞有毒性作用，可間接反映氧自由基的存在及對細胞的損傷程度，從而影響細胞增殖與凋亡[18-19]。

HIF-1α是HIF-1特有的活性亞單位，對HIF-1的活性發揮決定性作用。腫瘤細胞中的HIF-1α活性增加，表明腫瘤細胞的增殖與侵襲水平增加[20]。miR-9可通過靶向調控HIF-1α發揮對細胞各項生命活動的調節作用[21]。本研究顯示轉染后24、36 h，miR-9組的HIF-1α蛋白相對表達水平均低于對照組與miR-NC組（P<0.05），表明miR-9在妊娠滋養細胞的高表達能抑制HIF-1α的表達。不過本研究并未明確HIF-1α是否為miR-9的下游靶基因，后續還需要進行深入分析。

綜上所述，miR-9在妊娠滋養細胞的高表達能抑制HIF-1α的表達，維持氧化應激處于平衡狀態，從而促進細胞凋亡，抑制細胞增殖與侵襲。

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（收稿日期：2021-05-26） （本文編輯：張爽）