抗抑郁藥對海馬星形膠質細胞縫隙連接蛋白表達和通道功能的影響

梁沛彰?顏茹芳?張永華?黃煥森?汪靈芝

【摘要】目的 探討3種不同機制抗抑郁藥對海馬星形膠質細胞縫隙連接蛋白和通道功能的影響。方法 CCK-8實驗檢測不同機制抗抑郁藥對海馬星形膠質細胞的細胞毒性，采用蛋白免疫印跡法和細胞接種熒光示蹤法測定3種不同機制抗抑郁藥對由縫隙連接蛋白43（Cx43）組成的通道功能和Cx43蛋白表達的影響。結果 CCK-8實驗顯示，25.00 ?mol/L氟西汀、0.10 ?mol/L阿米替林和0.20 nmol/L文拉法辛對海馬星形膠質細胞無細胞毒性（P均> 0.05）; 25.00 ?mol/L氟西汀、0.10 ?mol/L阿米替林和0.20 nmol/L文拉法辛能抑制海馬星形膠質細胞縫隙連接的熒光傳遞功能（P均< 0.05），但3種抗抑郁藥均不影響海馬星形膠質細胞Cx43蛋白的表達（P均> 0.05）。結論 抗抑郁藥能夠顯著降低海馬星形膠質細胞Cx43組成的通道功能。

【關鍵詞】細胞縫隙連接;星形膠質細胞;海馬;抗抑郁藥;縫隙連接蛋白43

Influence of antidepressants on connexin expression and gap junction function of hippocampal astrocytes Liang Peizhang， Yan Rufang， Zhang Yonghua， Huang Huansen， Wang Lingzhi. Department of Anesthesiology， the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Guangzhou 510260， China

Corresponding author， Wang Lingzhi， E-mail： wlz4009@163.com

【Abstract】Objective To evaluate the effects of three antidepressants with different mechanisms on connexin expression and channel function of hippocampal astrocytes. Methods The cytotoxicity of antidepressants with different mechanisms on hippocampal astrocytes was assessed by CCK-8 assay. The effects of three antidepressants with different mechanisms on gap junction function and the expression level of connexin 43 protein （Cx43） were determined by cell inoculation fluorescence tracing and western blot. Results CCK-8 assay showed that 25.00 ?mol/L fluoxetine， 0.10 ?mol/L amitriptyline and 0.20 nmol/L

venlafaxine had no cytotoxicity on hippocampal astrocytes （all P > 0.05）. In addition， 25.00 ?mol/L fluoxetine， 0.10 ?mol/L amitriptyline and 0.20 nmol/L venlafaxine could significantly inhibit the fluorescence transfer function of gap junction in hippocampal astrocytes （all P < 0.05）， whereas three antidepressants exerted on effects upon the expression of Cx43 in hippocampal astrocytes （all P > 0.05）. Conclusion Antidepressants can significantly reduce the gap junction function composed of Cx43 in hippocampal astrocytes.

【Key words】Gap junction; Astrocyte; Hippocampus; Antidepressant;connexin 43 protein

作為邊緣系統的重要組成部分，海馬不僅參與學習、記憶與情感活動功能調控，同時在抑郁癥心境障礙的產生演化過程扮演重要的作用。海馬區富含星形膠質細胞。研究顯示，抑郁癥可以導致海馬體積的變化，同時星形膠質細胞也發生變化[1-2]。多種抗抑郁藥可通過影響星形膠質細胞而發揮作用。盡管近年來越來越多的研究證實星形膠質細胞在抑郁癥的發生發展中具有重要的作用[3-4]。

但目前為止，星形膠質細胞參與抑郁癥的具體機制仍不清楚，哪些分子可以成為抗抑郁藥的靶點還有待探究。細胞縫隙連接（GJ）是廣泛存在于各種實質性器官組織細胞之間的一類蛋白質連接通道。每6個連接蛋白（Cx）在細胞膜上作為連接子圍繞一起形成單個“半通道”。位于相鄰細胞膜上2個相對應的“半通道”結合成1個完整的GJ。研究發現，<1 kDa的小分子物質（細胞信號分子和代謝物質如離子、糖等）可通過GJ快速轉移、擴散到相鄰接的細胞。GJ是信息物質在細胞之間進行傳遞的一個重要節點。目前為止，人體中共發現有21種Cx，分別以其分子量進行命名。中樞神經系統內星形膠質細胞主要表達的Cx為Cx43[5-6]。近年研究證實，星形膠質細胞中Cx43蛋白及其組成的通道功能異?？赡芘c抑郁癥密切相關[7]。我們通過前期的實驗證實，海馬星形膠質細胞Cx43蛋白通道參與了抑郁情緒障礙，但抗抑郁藥是否影響海馬星形膠質細胞Cx43蛋白表達和通道功能至今未見報道。為此進行本研究，探討3種不同機制抗抑郁藥對海馬星形膠質GJ蛋白和通道功能的影響，現報告如下。

材料與方法

一、細胞來源和試劑

原代星形膠質細胞取材于清潔級2～3 d的無特定病原體（SPF）大鼠乳鼠，大鼠乳鼠購于廣東省動物實驗中心。本研究方案經醫院倫理委員會批準（倫理批件號：B2021-022）。本課題中采用的實驗試劑：青霉素、鏈霉素、胰酶、DMEM干粉和胎牛血清等購于美國Gibco公司，氟西汀、阿米替林和文拉法辛購于上海麥克林生化科技有限公司，CCK-8試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司， Calcine-AM購于Invitrogen -Thermo fisher公司，Cx43羊抗鼠單克隆抗體和β-actin羊抗鼠單克隆抗體購于美國Sigma公司，二抗購于Abcam公司。

二、方 法

1. 星形膠質細胞的純化和培養

取2～3 d的SPF大鼠乳鼠5只，低溫麻醉后打開顱骨，取出大腦，置于含預冷DMEM的培養皿中，解剖顯微鏡下取出海馬，分離星形膠質細胞。星形膠質細胞貼壁后輕搖換液1次，去除死亡的細胞碎片，2～3 d換液1次，細胞培養7～9 d，置37 ℃恒溫搖床搖振過夜（200 轉/分，16 h），棄上清后貼壁較牢的為星形膠質細胞，經胰酶消化星形膠質細胞，重懸后采用高糖DMEM 培養基（內含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）培養和傳代星形膠質細胞，進行后續實驗[8]。

2. CCK-8實驗檢測抗抑郁藥對星形膠質細胞的毒性作用

在96孔板中，接種原代培養的星形膠質細胞（1000個/孔），3種抗抑郁藥氟西汀、阿米替林、文拉法辛參考既往文獻報道設置不同的藥物濃度組別，每組設置4孔，分別加入200 μL培養基培養，細胞培養24 h 后通過 CCK-8試劑盒對細胞的活力進行測定，通過酶標儀于490 nm檢測各孔的吸光度（D）值，根據公式：

細胞存活率=（D實驗孔-D空白孔）/（D對照孔-D空白孔）

×100%

計算抗抑郁藥對星形膠質細胞的活性，重復上述實驗3次，結果取平均值。

3. 蛋白免疫印跡法檢測Cx43在海馬星形膠質細胞的表達

采用蛋白免疫印跡法，裂解細胞獲取蛋白，并與標準蛋白比較進行目標蛋白定量（Bio-rad DC蛋白定量試劑盒），制備電泳凝膠，20 μg蛋白進行上樣，Bio-Rad電泳儀電泳，轉膜液轉膜，脫脂奶粉封閉，4 ℃孵育一抗（抗Cx43單克隆抗體，1∶6000;抗β-actin單克隆抗體，1∶8000），二抗孵育30 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后，ECL發光試劑孵育。Bio-Rad凝膠成像系統收集圖像，用生物圖像系統（Gene Genius）分別對Cx43和β-actin條帶進行灰度掃描分析。

4. 細胞接種熒光示蹤法檢測海馬星形膠質細胞GJ 熒光傳遞功能

由于綠色熒光試劑Calcine-AM進入細胞經酶解后不能自由通過細胞膜但能通過GJ進入鄰接細胞，以倒置熒光顯微鏡計數通過GJ染上綠色熒光的細胞數量，檢測GJ功能。取星形膠質細胞接種于6孔板，培養3～4 d后待細胞相互融合，通過將Calcine-AM試劑與細胞共同孵育使該細胞染有綠色熒光，將該細胞定義為 “供體細胞”。將經胰酶消化后的“供體細胞”接種至經不同抗抑郁藥處理過的融合星形膠質細胞上，供體細胞接種4 h待與周圍細胞融合，星形膠質細胞通過穩定的GJ（綠色熒光），由“供體細胞”進入鄰接細胞。通過倒置熒光顯微鏡，計數一個“供體細胞”周圍含有綠色熒光的星形膠質細胞數目， 作為檢測GJ功能的指標。

三、統計學處理

采用SPSS 13.0分析數據，計量資料以? 表示，不同組與對照組間比較采用方差分析和Dunnett-t檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、抗抑郁藥對海馬星形膠質細胞的細胞毒性

為了排除抗抑郁藥的細胞毒性影響細胞數量，從而對GJ功能產生影響，本研究首先用CCK-8法檢測3種抗抑郁藥對海馬星形膠質細胞細胞毒性的影響。與對照組相比，50.00 μmol/L氟西汀，1.00、10.00和100.00 μmol/L阿米替林及20.00 nmol/L文拉法辛的細胞活力下降（P均< 0.05），表明藥物在這些濃度下能抑制星形膠質細胞的生長，見表1。因此，后續實驗中選取該3種抗抑郁藥無細胞毒性的較高濃度進行研究，即25.00 μmol/L氟西汀、0.10 μmol/L阿米替林和0.20 nmol/L文拉法辛。

二、抗抑郁藥對海馬星形膠質細胞Cx43蛋白表達的影響

蛋白免疫印跡法顯示，與對照組比較，海馬星形膠質細胞Cx43在25.00 ?mol/L氟西汀、0.10 ?mol/L阿米替林和0.20 nmol/L文拉法辛作用下未影響其表達。對各組條帶的灰度值進行統計分析（內參照為β-actin 灰度值），組間差異均無統計學意義（P均> 0.05），見圖1。

三、抗抑郁藥對海馬星形膠質細胞Cx43組成的GJ通道功能的影響

細胞接種熒光示蹤顯示（圖2），與對照組相比，25 ?mol/L氟西汀能夠降低海馬星形膠質細胞熒光傳遞功能，熒光傳遞功能約為對照組的（46±2）%;0.1 ?mol/L阿米替林能夠降低熒光傳遞功能，熒光傳遞功能約為對照組的（66±3）%;0.20 nmol/L文拉法辛能夠降低海馬星形膠質細胞熒光傳遞功能，熒光傳遞功能約為對照組的（62±3）%，氟西汀與對照組比較差異有統計學意義（P < 0.01）;阿米替林和文拉法辛與對照組比較差異亦有統計學意義（P均< 0.05），表明3種抗抑郁藥均可以降低海馬星形膠質細胞由Cx43所組成的GJ功能。

討論

抑郁癥是一類嚴重的心境障礙，心境低落為抑郁癥的顯著特征，情緒低落、興趣減退、活動減少的“三低”癥狀為抑郁癥的主要臨床表現。抑郁癥影響全球3.8%的人口，但其發病機制仍不十分清楚[9]。腦內去甲腎上腺素和5-羥色胺等單胺類神經遞質水平低下被認為與抑郁癥的發生密切相關，目前經典的抗抑郁藥在臨床上的應用仍存在療效滯后，重癥患者通過藥物或聯合心理治療后仍會出現抗治療反應和易復發等問題[10-12]。近年多項研究顯示，廣泛存在于神經元周圍的星形膠質細胞在抑郁癥患者和動物模型中有形態和功能的改變，同時還伴隨谷氨酸受體和轉運體的異常[3， 13]。Liu等[14]發現，抗抑郁藥帕羅西汀和單胺氧化酶抑制劑氯丙咪嗪能夠明顯增加抑郁模型大鼠海馬區星形膠質細胞標志性蛋白GFAP的表達。研究者認為，星形膠質細胞可能是抑郁癥發生的根本原因，而針對星形膠質細胞的治療有望成為潛在的治療靶點[15]。

抑郁癥的發生伴隨腦內多個部位（皮質、海馬、杏仁核等）的結構和功能異常。海馬是邊緣系統的主要組成部分，是學習、情感和記憶等高級神經活動的重要腦區。抑郁癥可導致海馬體積的變化、神經突觸可塑性改變，興奮性氨基酸、單胺類神經遞質分泌異常和神經營養因子等表達下調[1]。在多種不同應激模式導致的抑郁動物模型中，研究者發現海馬區星形膠質細胞的數量和形態發生異常[2]。氟西汀在臨床上廣泛應用，通過選擇性抑制5-羥色胺再攝取發揮作用。阿米替林是三環類抗抑郁藥，是第一代單胺氧化酶再攝取抑制劑。文拉法辛是苯乙胺的衍生物，通過抑制5-羥色胺與去甲腎上腺素再攝取發揮作用。本研究通過CCK-8實驗證實3種不同機制的抗抑郁藥氟西汀、阿米替林和文拉法辛在一定濃度范圍內對海馬星形膠質細胞無抑制作用。蛋白免疫印跡法和熒光示蹤法結果首次證實3種抗抑郁藥均能夠明顯抑制星形膠質細胞Cx43組成的GJ功能，但不影響Cx43蛋白表達。既往研究通過細胞劃痕實驗證實氟西汀、阿米替林和文拉法辛等抗抑郁藥能夠明顯抑制小鼠皮質星形膠質細胞Cx43組成的GJ功能，但不影響Cx43蛋白表達[16]。但其并未就抗抑郁藥對海馬星形膠質細胞GJ功能進行研究。組織細胞微環境中酸堿值、游離鈣離子、細胞膜電位、連接蛋白磷酸化等多種因素可影響GJ的開放與閉合狀態。研究表明Cx43的磷酸化能夠導致GJ功能改變[17]。Quesseveur等[18]報道，長期給予糖皮質激素的小鼠出現的抑郁樣行為伴隨海馬Cx43磷酸化增多，而應用抗抑郁藥氟西汀能夠明顯減少Cx43磷酸化和抑郁樣癥狀。由此推測，抗抑郁藥對GJ功能的影響可能與其磷酸化的改變有關，但仍需后續研究證實。

Cx及其組成通道與抑郁癥的發生關系密切。研究者在抑郁癥患者的尸檢結果以及急性、慢性應激導致的抑郁模型上均發現大腦 Cx43 表達的改變[19]。同時動物研究還顯示，抗抑郁藥可通過影響海馬或者前額葉Cx43蛋白或半通道的功能在慢性應激或者糖皮質激素慢性給藥引起的抑郁大鼠中產生抗抑郁作用[20]。這些研究結果均表明，皮質或額葉的星形膠質細胞Cx43蛋白及組成通道在抑郁癥的發生過程中具有極其重要的作用。本研究首次發現抗抑郁藥能夠明顯改變海馬星形膠質細胞Cx43組成的GJ功能，這提示海馬星形膠質細胞Cx43可能在抑郁癥發生中起重要的作用。區別于以往主要針對神經元為靶點的藥物開發，海馬星形膠質細胞有望成為新的治療靶點。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-09-16）

（本文編輯：林燕薇）