大鼠異位心臟移植對心臟減負荷模型制作的價值

劉永輝?孟嘉天?孟自力?蔡會卿?劉何利?周香坦

【摘要】目的 探討大鼠心臟減負荷模型的制作要點，為心力衰竭患者使用左心室輔助裝置恢復機制提供實用模型。方法 同系29只lewis成年大鼠，通過結扎冠狀動脈前降支形成缺血性心肌病，用UCG篩選符合心力衰竭條件的大鼠。將24只心力衰竭大鼠隨機分為2組：減負荷組（n = 14）與心衰組（n = 10）。心衰組不進行心臟移植。減負荷組對心力衰竭大鼠心臟作為供體異位移植于受體腹部下腔靜脈及腹主動脈，形成左心室減負荷模型。另設空白對照組（n = 8），這些大鼠僅僅接受開胸手術，而不實施冠狀動脈前降支的結扎，其它處理方式同以上2組。實施心臟移植2周后，分別對3組小鼠進行檢測。檢測指標包括測量左室舒張末壓、最大壓力上升速率（+dp/dtmax）及左室收縮壓，并作心臟病理切片檢測組織學改變。結果 缺血性心肌病心力衰竭動物模型成功率為 82.76 %（24/29），心力衰竭大鼠進行心臟減負荷后的存活率是 71.43%（10/14）。與心衰組相比，減負荷組左心室發展壓升高（47.85±0.94 vs. 35.94±0.95，F = 250.993，P < 0.05），左心室+dp/dtmax升高（1177.85±61.03 vs. 841.64±40.26，F = 942.304，P < 0.05）。結論 利用大鼠作為實驗動物，通過先制作心肌梗死心力衰竭模型，再對其進行異位心臟移植，可作為經濟、可重復的心室減負荷模型。

【關鍵詞】動物模型，大鼠;左心室輔助裝置;減負荷;心臟移植

Role of heterotopic heart transplantation in establishment of rat models with unloading the infarcted hearts Liu Yonghui△， Meng Jiatian， Meng Zili， Cai Huiqing， Liu Heli， Zhou Xiangtan. △Hebei Chest Hospital， Shijiazhuang 050041， China

Corresponding author， Meng Zili， E-mail： Dr_zilimeng@yahoo.com

【Abstract】Objective To investigate the highlights of establishing a rat model of mimicking left venticular assist device （LVAD） by unloading rat infarcted hearts. Methods 29 adult Lewis rats were ligated the left anterior discending arteries to shut the blood supply of myocardium to establish the infarcted heart failure rat models. Electrocardiogram （ECG） was performed to screen the rat models with heart failure. 24 heart failure rats were randomly divided into the unloading group （n = 14） and heart failure group （n = 10）. Heart transplantation was not performed in the heart failure group. In the unloading group， the hearts of heart failure rats were prepared for heterotopic cardiac transplantation into the inferior vena cava and abdominal aorta of the recipient rats to establish the left ventricular unloading models. In the blank control group （n = 8）， the rats were intervened with open surgery alone. The remaining interventions were similar to those in the other two groups. At 2 weeks after cardiac transplantation， the left ventricular end-diastolic pressure （LVEDP）， maximum left ventricular pressure rising/falling rate （±dp/dtmax） and left ventricular systolic pressure （LVSP） were measured. Histological changes of the rat hearts were observed. Results The success rate of heart failure rat models after ischemic cardiomyopathy was 82.76% （24/29）. The survival rate of heart failure rats after cardiac unloading was 71.43% （10/14）. Compared with the heart failure group， the left ventricular developed pressure （LVDP） was significantly elevated （47.85±0.94 vs. 35.94±0.95，F = 250.993， P < 0.05） and the ±dp/dtmax was significantly increased （1177.85±61.03 vs. 841.64±40.26，

F = 942.304，P < 0.05） in the unloading group. Conclusion The rat models with heart failure can be established by myocardial infarction and subsequently receive heterotopic heart transplantation， which offers an economical and reproducible model of ventricular unloading.

【Key words】Animal model，rat; Left venticular assist device; Unloading; Cardiac transplantation

心力衰竭是人類健康的主要殺手之一。終末期心力衰竭藥物治療效果不佳，需要心臟移植或心室輔助裝置。心室輔助裝置，尤其是左心室輔助裝置（LVAD）是用來部分替代心臟的泵血功能、維持良好全身循環狀態的機械裝置[1-2]。作為一種血泵，LVAD能夠降低左室容量及壓力負荷，通過增加肺靜脈回流，降低右室后負荷，是治療終末期心力衰竭的重要手段之一，除了具有心臟移植“橋梁”作用 ，還可以通過減少心肌梗死面積、保護心肌成為治療終末期心臟病“心臟功能恢復的橋梁”，但其機制尚未清楚[1-4]。有關LVAD機制研究，通常通過豬、犬、羊等大動物進行試驗，但其實驗周期長、成本高昂[5-6]。因此，本試驗以成本較低的大鼠為試驗動物，先制作心力衰竭模型再進行心臟移植，制作心臟減負荷模型以模擬心室輔助裝置，為下一步研究心室輔助裝置改善心臟功能的機制創造條件。

材料與方法

一、實驗動物

體質量180～220 g、同系lewis成年雄性大鼠29只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。本實驗符合動物實驗相關倫理規范。

二、實驗儀器及器械

小動物麻醉呼吸機（Harvard ventilator model 683，美國Harvard公司）、UCG機（Philips Sonos 5500超聲儀，探頭頻率12 MHz）、壓力傳感器（model ML110， AD Instruments Pty Ltd， 澳大利亞）、放大器（SP8502， Powerlab/8SP， AD Instuments Pty Ltd，澳大利亞）、手術器械（包括進口筆式持針器、7/0 PROLENE線等）。

三、實驗方法

1. 制備大鼠心肌梗死模型

參考文獻[7]使用29只180～220 g雄性lewis大鼠，使用683型小動物麻醉呼吸機，以氧氣和異氟醚的混合氣體進行吸入式麻醉。全身麻醉成功后，經第5肋間逐層切開各層組織，以左心耳下緣平齊位置作為標記，利用8/0 prolene線試結扎前降支，試結扎前降支10 s后松開結扎線以造成缺血預適應，再次徹底結扎前降支，見圖1。本模型制作成功標準是心臟前壁局部顏色轉為蒼白、心電圖顯示有心肌梗死表現，有的可出現室性心律失常。模型制作成功后逐層縫合，于拔除氣管插管前肌內注射0.1 mL（1.2萬單位）長效青霉素。

2. 超聲評價大鼠心肌梗死模型的制作

通過吸入氧氣和異氟醚的混合氣體來誘導麻醉大鼠（氧氣量2 mL/min，異氟醚2～3 mL/min維持麻醉）。麻醉穩定后使用UCG進行大鼠心臟功能的檢測。檢測指標包括室腔于收縮及舒張期大小、左室前壁收縮及舒張厚度、對應左室后壁收縮及舒張厚度，計算LVEF、左室短軸縮短率（FS）[7-8]。再取二尖瓣血流入口處二維超聲測量多普勒頻譜，測量E峰、A峰、計算EA比值。典型大鼠心肌梗死后4周表現為左室短軸切面顯示左室前壁、前間壁心肌結構消失，回聲增強，運動幅度減低或消失，左室前壁部分室壁明顯變薄。評價心肌梗死模型標準：①客觀指標，心臟FS值< 30%;②主觀指標，超聲科醫師判斷至少有一個層面前壁室壁收縮運動明顯異常。只有同時符合2個指標才可入選進行下一步試驗。將符合標準的lewis大鼠隨機分為2組。

3. 實驗分組

將24只心力衰竭大鼠隨機分為2組：減負荷組（n = 14）與心衰組（n = 10）。心衰組，對于心肌梗死心力衰竭大鼠不進行心臟移植。減負荷組將心肌梗死心力衰竭大鼠心臟移植于另一大鼠腹主動脈及下腔靜脈內，使供體大鼠的升主動脈、肺動脈分別與受體大鼠的腹主動脈、下腔靜脈相吻合，保持供體心臟始終跳動，同時，由于供體大鼠的左心室始終保持空跳，幾乎不做功，從而心臟可以得到充分休息，達到心臟減負荷目的[7]。如果供體心臟存活良好則表現為心率在170～210次/分、心跳有力，如果腹部不能捫及心跳，則作為實驗失敗計算。另設空白對照組（n = 8），對于接受實驗的大鼠僅僅實施開胸手術，但是對于大鼠的冠狀動脈不進行結扎操作。在實施以上操作的2周后，分別對移植減負荷后的心力衰竭心臟、未行移植減負荷的心力衰竭心臟及正常心臟實施取材，進行下一步操作。

4. 大鼠心臟離體灌流心功能測定

在大鼠檢測心臟UCG之后，用Langendoff模型行離體心功能測定。用10%烏拉坦（1.5 g/kg）腹腔注射進行全身麻醉后，通過舌下靜脈注射肝素 （3 mg/kg），以防止血栓形成。隨后，將大鼠置于動物手術臺上、仰臥位，用碘伏消毒、鋪巾后，行上腹部膈肌下橫切口，逐層切開皮膚、皮下組織，注意勿傷及肝臟和脾臟，然后再縱行向上剪開膈肌、胸骨，顯露心包及心臟、主動脈。在心包腔內倒入冰屑及冰水混合物。將心臟、主動脈連同肺臟一起取出，立即置于冰水混合物中[9]。仔細修剪心臟、主動脈、肺動脈，保留盡量長的升主動脈以便操作。將升主動脈接上灌流管，將乳膠囊經左心房切口置于大鼠左心室內，連接壓力傳感器和放大器，然后將左心耳剪開，排氣以免氣體進入冠狀動脈，打開灌流開關，開始灌流。離體灌流液采用37℃ Krebs-Henseleit（KH）緩沖液 （pH 7.4，NaCl 118 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，

CaCl2 2.5 mmol/L，NaHCO3 25 mmol/L，KH2PO4 1.2 mmol/L，MgSO4 1.2 mmol/L，葡萄糖11 mmol/L）。在離體心臟灌流復跳穩定30 min后，檢測心臟的離體功能。開始時將0.04 mL 0.9% NaCl注射液注射于左心室球囊，隨后每次逐漸增加0.02 mL NaCl注射液，一直到左心室舒張末壓力超過30 mm Hg

（1 mm Hg=0.133 kPa）為止。在每次注射0.9% NaCl注射液之后，等待描記曲線穩定后記錄心率曲線、dp/dt曲線及左心室壓力曲線，每次記錄時間30 s。在實驗結束后，使用POWERLAB配套軟件Chart 4.0 for Windows計算每個測定點舒張末dp/dt、

舒張末壓力、最大壓力上升速率（+dp/dtmax）、收縮末壓力以及心率平均值，同時，需要計算左心室發展壓（LVDP），LVDP =收縮末壓力-舒張末壓力。

5. 病理學檢測

提前準備好10% KCl注射液10 mL，在心臟離體灌流實驗后，立即經主動脈注入使心臟停搏，然后用0.9% Nacl注射液250 mL將心臟沖洗干凈，最后將心臟放置于冰屑濕紗布上。每只大鼠的心臟部分用免疫組織化學染色、部分以10%中性甲醛固定準備用于石蠟切片檢測。

四、統計學處理

應用 SPSS 22.0對數據進行統計分析。計量資料以? 表示，多組間樣本均數的比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，2組間定性資料進行χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、動物存活率

共取29只 lewis 大鼠做心肌梗死后心力衰竭模型，其成功率是 82.76% （24/29），死亡大多數發生于心肌梗死后 48 h;用心肌梗死后心力衰竭模型再次進行心臟異位移植制作心力衰竭后減負荷模型，其存活率是 71.43% （10/14） ， 后者的死亡大多發生于術后 10 h，與國外文獻相似[10]。

二、心功能的超聲評價

與空白對照組相比，移植前減負荷組與心衰組LVEF下降，差異有統計學意義（P < 0.05），但減負荷組與心衰組間的LVEF比較差異無統計學意義（P > 0.05）。與空白對照組相比，移植前心衰組與減負荷組的FS下降，差異有統計學意義（F = 11.104，P < 0.05），但減負荷組與心衰組的FS比較差異無統計學意義（P > 0.05），見表1。

三、離體心臟灌注評價心功能

Langendorff 模型心功能評價結果顯示，缺血性心臟病心力衰竭的心臟功能在減負荷2周后可以得到改善。與心衰組相比，在左心室球囊容積為0.04 mL時，減負荷組LVDP升高，差異有統計學意義（47.85±0.94 vs. 35.94±0.95，F = 250.993，P < 0.05）， +dp/dtmax升高，差異有統計學意義（1177.85±61.03 vs. 841.64±40.26，F = 942.304，P < 0.05），見圖2。

四、各組大鼠心臟組織學檢查

大鼠心肌HE染色顯示各組心肌細胞排列及炎性細胞浸潤情況：空白對照組心肌細胞排列整齊，無炎性細胞浸潤;心衰組可見心肌細胞壞死、排列紊亂，有大量炎性細胞浸潤及纖維素沉積;減負荷組心肌細胞壞死、排列仍紊亂，纖維素沉積及炎性細胞浸潤較心衰組稍輕（圖3）。

五、各組大鼠心肌天狼星紅染色

天狼星紅染色將肌細胞染成黃色，膠原纖維染成紅色。空白對照組心肌細胞排列整齊;心衰組心肌細胞排列紊亂;減負荷組心肌細胞排列仍紊亂較心衰組稍輕（圖4）。

討論

終末期心力衰竭單純藥物治療效果不佳，往往需要心臟輔助裝置、心臟泵或心臟移植[11-12]。其中，心室輔助尤其是LVAD可以部分替代心臟泵血功能，從而減輕心臟負荷，有力于心臟功能恢復，或可以使患者等到供體，也可促進干細胞的成活率。對于LVAD撤機的時機需要進一步了解，因為有的病種通過LVAD恢復快，而有的恢復差[13-14]。

在本試驗中，血液循環的方向為：血液從（受體大鼠）腹主動脈流至（供體大鼠）升主動脈，然后 流到（供體大鼠）冠狀動靜脈，之后從（供體大鼠）右心房到（供體大鼠）右心室再流至（供體大鼠）肺動脈，最后到達（受體大鼠）下腔靜脈，由于（供體大鼠）左心室不參與循環，處于半休息狀態無負荷異位心，從而使（供體大鼠）左心負荷減輕，這一點與臨床上左心輔助裝置有一定相似之處。

本試驗創新點在于先制作缺血性心力衰竭模型，在此基礎上，對缺血性心力衰竭大鼠再進行心臟減負荷的模型制作，因此，更能模擬臨床上缺血性心肌病的臨床實踐[12， 14]。2005年Mizuno等[15]進行了大鼠心臟減負荷和再負荷試驗，但做實驗使用的是正常大鼠的心臟，其心臟減負荷不能等同于心肌梗死心力衰竭心臟減負荷模型。因此，不能很好地模擬臨床上缺血性心肌病的心臟減負荷，以至于使用這種模型進行減負荷的機理探討有一定局限性。

在試驗中尤其需要注意以下幾點：①要有良好的供心保護，a.提前準備好冰屑，在打開供體的胸腔后立即將冰屑置于心臟周圍以便使供心迅速降溫停跳，從而減少供心在無氧代謝下的能量損耗;b.在整個心臟移植手術過程中始終在供心周圍放置冰屑從而使之持續降溫，達到低溫保護[9]。②供體肝素化的問題，為了防止損傷心肌，在經下腔靜脈注射肝素鹽水時不能注射太快[9， 16]。③減少術中出血，a.吻合口出血是開放血管后出血的主要原因[7]。在檢測動脈吻合口、準備開放近端血管夾時，可采取多次間斷放松血管夾的方式，通過這種方式，動脈內的血液壓力可以使得吻合口的縫線排列更趨于均勻分布，從而使得針眼處有凝血機會，達到止血目的。在這些操作基礎上，如果動脈出血仍較多，則需要在出血部位增加縫合1～2針以便止血，同時適量補液以補充丟失的液體;b.防止損傷心耳，在手術中不要用器械尖端直接鉗夾心耳，可以防止損傷心耳，從而減少出血;c.在分離下腔靜脈和腹主動脈時，應使用顯微鑷輕輕牽開靜脈與動脈之間的疏松組織，然后稍加分離至足夠的長度。如果吻合段內腹主動脈的后壁有小血管分支，可以在無血管區穿線進行結扎。④縮短供體心冷缺血時間，先顯露并游離好受體血管的吻合段，之后再獲取供心，這樣可以縮短供體心臟的冷缺血時間[9]。⑤預防血栓形成，將供心迅速取下之后立即放入冰的生理鹽水中，并輕輕擠壓心臟使心腔內殘余血液盡快流出來，從而避免血栓形成[14]。

綜上所述，以大鼠為實驗動物，先制作缺血性心力衰竭模型，在此基礎上再通過心臟異位移植的方式，可以構建心室輔助減負荷的動物模型，該模型費用相對低、可重復性好、操作相對簡單，易于推廣及進行進一步研究。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-09-13）

（本文編輯：楊江瑜）