植物根際促生菌Bacillus mycoides Gnyt1菌株生物學特性比較研究

楊曉玫, 馮 起, 呂丹彤, 姚 拓, 李 琦, 謝華山

(1.中國科學院西北生態環境資源研究院內陸河流域生態水文重點實驗室， 甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅農業大學草業學院，甘肅 蘭州 730070； 3.草業生態系統教育部重點實驗室， 甘肅 蘭州 730070； 4.中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

植物根際促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)特性，是指促生菌適宜的生長環境以及突出的特性，能反映促生菌保藏前后的穩定性[1]。植物根際促生菌的特性(如生長速度、遺傳穩定性、營養價值以及抗病性大小等)能直接決定菌株的利用價值和工業開發。菌株生長速率較快，容易培養和開發，能提高工業化的生產效率；菌株遺傳穩定性高，能增加工業化生產的穩定性和可操作性；菌株營養價值較高，能降低培養成本，降低其產品的經濟價值；菌株抗病性強，能有效抵御病原菌的入侵，阻止雜菌的污染[2]。PGPR具有促進植物的生長，抑制植物病原菌繁殖，改善植物根際微生態，降低土壤污染物含量等作用，其常被制成生物菌肥(菌液)替代或部分替代化肥和農藥的使用，能有效改良土壤及防止土壤退化[3-4]。對優良根際促生菌的研究，需評價菌株穩定性，不能針對單一突出特性片面研究。

植物根際促生菌的合理保藏是后期研究的基礎，其主要目的是使篩選得到的優良菌株減少雜菌污染、變異、死亡，降低微生物菌株的新陳代謝，減緩促生菌的生長，并使菌株保持良好的活性[5]。不同的保藏時間，菌株的生長速率等生物學特性不同，保藏方法不恰當及保藏時間過長，菌株的生長速率會出現一定程度的降低[6-8]，故對促生菌株活性和穩定性的檢測尤為重要。低溫冷凍斜面保藏通過控制菌株生長的溫度、濕氣及氧氣等，抑制微生物的生長代謝活動，使菌株的生長繁殖處于休眠狀態，其代謝處于最低水平，不易產生生產能力退化現象，并保持菌株自身的生物學特性[9]。針對不同的菌株類型有不同的保藏方法，保藏后菌株的生物學特性需進行比較研究，變化趨勢低的方可進行后期的研究和開發利用[10-11]。

PGPR是一類優良植物根際促生菌，因其突出的特性被大量開發為微生物菌肥或微生物菌劑等，但促生菌特性可能會因為保藏時間過長或菌株的穩定性差等原因發生改變，直接影響菌株后續研究的正確性[12-14]。前期的研究已經證實BacillusmycoidesGnyt1菌株有優良的開發潛力[15]，目前針對芽孢桿菌保藏前后生物學特性的基礎研究和芽孢桿菌的分子生物研究鮮有報道，因此，本文以保藏兩年后的BacillusmycoidesGnyt1菌株為研究材料，再次測定其菌株的特性，參照保藏前BacillusmycoidesGnyt1菌株的特性指標，檢測BacillusmycoidesGnyt1菌株特性的穩定性，以期為后續BacillusmycoidesGnyt1菌株比較基因組學和功能基因等方面的深入研究提供理論依據和可靠的保障。

1 材料與方法

1.1 材料

研究菌株BacillusmycoidesGnyt1是2014年分離自天祝高寒草地優勢植物珠芽蓼(Polygonumviviparum)根際的一株優良根際促生菌[12]，低溫冷凍斜面保藏于甘肅農業大學草業學院草地微生物多樣性實驗室。2017年本課題組測定發現其生物特性表現突出穩定性較高[15]，對照菌株Gm92，426，89，93等均為課題組前期研究中積累的優良菌株材料，均為低溫冷凍斜面保藏，其特性見表1。菌株保藏2年后，對其生物學特性進行測定。

表1 對照菌株的功能特性Table 1 Features of the benchmark

1.2 方法

1.2.1菌株保藏 菌株保藏采用低溫冷凍斜面保藏法，試管中配制LB固體斜面培養基，待冷卻凝固后用無菌接種針接種已培養好的菌株，采用S型分別在試管LB固體斜面培養基上劃線，置于-20℃冷凍冰箱隔離保藏，間隔60天重復此方法活化并置冰箱保藏。

1.2.2菌株生長曲線測定 分別使用兩步法活化菌株，即Luria-Bertani(LB)固體培養基(pH=7)第一次活化，次日轉入LB培養液(pH=7)28℃ 180 r·min-1培養24 h左右，至菌株的OD600相同。采用平板涂布法每隔4 h取樣1 mL培養液，等間隔取樣至72 h，測定不同時間及不同時期的菌株活菌的數量，分析數據并繪制菌株生長曲線。

1.2.3菌株對pH的適應能力測定 分別配置pH為4，5，6，7，8，9的LB液體培養基，不同菌株分別等量接種于不同pH培養液中，28℃條件培養48 h，測定菌株OD600值及有效活菌數，分別涂布于固體培養基計算有效活菌數，并對比分析不同pH對不同菌株生長的影響。

1.2.4菌株對溫度耐受性的測定 分別使用兩步法活化菌株，即LB固體培養基(pH=7)第一次活化各菌株，次日轉入LB培養液28℃ 180 r·min-1培養24 h左右，至菌株的OD600相同進行測定。取1 mL菌株培養液轉接至LB液體培養基(pH=7)中，設置未轉接菌株培養液為空白對照，分別置于4℃，8℃，12℃，16℃，20℃，24℃，28℃，32℃，36℃，40℃恒溫培養32 h，32 h后取樣測定菌株OD600及有效活菌數，分析不同溫度對菌株生長的影響。

1.2.5菌株溶磷特性的測定 菌株溶磷特性的測定采用鉬藍比色法，配制150 mL蒙金娜液體培養基和PKO液體培養基，使用無菌接種針分別依次將菌株接種至液體培養基中，28℃180 r·min-1培養14 d，取出5 mL上清液，4℃ 10 000 r·min-1離心10 min，加至45 mL 0.5 mol·L-1NaHCO3中，繼續加入1 g無磷活性碳粉，震蕩后過濾，分別取相同的過濾液，加入顯色液，測定其吸光值并依據公式計算菌株磷含量[2]

公式如下：

在上式中，ρ代表溶液中的磷含量，單位為μg·mL-1；V代表待測液的體積，單位為mL；Ts代表分取的倍數；V0代表所取的待測菌株培養液的體積，單位為mL。

1.2.6菌株固氮特性的測定 菌株固氮特性的測定采用乙炔還原法，均以固氮酶活性表示，以nmol(C2H4)·h-1·mL-1為單位，具體試驗方法如下：配制NFM半固體培養基，放入滅菌西林瓶中，培養基中分別接入待測菌株，塞入純棉透氣塞封口，28℃恒溫培養48 h后將純棉透氣塞換為橡膠密封塞，培養數分鐘，使用無菌針管抽出1 mL空氣，繼續注入等體積乙炔，密封置于28℃恒溫箱中培養48 h，最后用氣相色譜法分別測定培養后瓶內混合氣體中乙炔的濃度大小，根據公式計算出各菌株的固氮酶活性[2]：

公式中，N表示待測菌株的固氮酶活性，單位為nmol(C2H4)·h-1·mL-1；Hx代表測出的乙炔的峰面積；C為最后培養后混合氣體中乙炔的濃度，單位為nmol·mL-1；V代表所選用的西林瓶的容積，單位為mL；Hs代表標樣乙炔的GC峰面積；t代表待測菌株培養的時間，單位為h；24.9表示標準C2H4氣體在測試時的體積(mL)[1]。

1.2.7菌株分泌植物激素(吲哚乙酸(Indole acetic acid，IAA))特性的測定 菌株分泌植物激素(IAA)特性采用HPLC法測定。具體試驗方法如下：配置LB液體培養基，分別接入待測菌株，28℃恒溫條件180 r·min-1暗培養72 h，隨后分別將培養液低溫10 000 r·min-1離心15 min，無菌離心管中收集離心所得的上清液，加入至活化好的SPE柱內，10%甲醇淋洗，80%甲醇洗脫，采用氮氣吹干法濃縮洗脫液，參考劉婷等[12]的色譜條件，使用HPLC法依次檢測。

1.2.8數據處理與分析 采用Excel 2010整理數據，軟件SPSS 19.0進行單因素方差分析，多重比較采用新復極差法(Duncan)，顯著性水平設為0.05，數據表示為“均值±標準差”，采用Sigmaplot 10.0軟件進行統計作圖。

2 結果與分析

2.1 菌株生長動態的測定

菌株的生長曲線反映了菌株在培養生長過程中繁殖和衰退的規律，菌株在適宜的條件下培養，會有延滯期、對數期、穩定期和衰退期4個時期。圖1為研究菌株BacillusmycoidesGnyt1和4株對照菌株的生長曲線。所有菌株從各自培養基接至新配好的培養液中均有適應期，主要表現為菌株生長比較緩慢，以適應不同的新環境，不同菌株的適應期很接近。在接種第12 h以后，菌株均能迅速繁殖，進入對數生長期，各菌株的菌體迅速增長。但菌株的類型不同，進入對數期的生長速率不相同，表現為不同菌株24 h菌株生長量不相同，研究菌株BacillusmycoidesGnyt1在24 h對數期的生長速率最高，證明其增殖速率最快。所有菌株培養至36 h～48 h，均緩慢進入穩定生長期，所有菌株在60 h之后慢慢進入衰亡期。菌株類型不同則生長速率不相同，本研究中菌株BacillusmycoidesGnyt1和對照菌株Ensifermeliloti93的生長速率高于其余三株菌。

2.2 菌株最適pH的測定

不同的pH值變化會直接影響菌株的生長速率。由圖2可知，在生長環境pH低于4時，菌株均不生長。在生長環境pH高于4時菌株開始慢慢生長，菌株活性較低，研究菌株和對照菌株之間的差異不明顯。在生長環境pH達到5時，所有菌株開始生長，不同的菌株有一定的差異，菌株Ensifermeliloti93生長最緩慢，Ensifermeliloti426和Bacillussubtilis89菌株次之，研究菌株BacillusmycoidesGnyt1和Pseudomonassp. Gm92生長狀況最佳。在菌株生長環境pH為6～7時，對照菌株Pseudomonassp. Gm92，Bacillussubtilis89和研究菌株BacillusmycoidesGnyt1的生長速率達到最高值，而菌株Ensifermeliloti426和菌株Ensifermeliloti93達到最大生長率的環境pH值為8。在菌株生長環境pH超過9時，研究菌株BacillusmycoidesGnyt1和對照菌株Pseudomonassp. Gm92生長速率逐漸下降，其他菌株的生長速率下降，菌株生長環境pH繼續增加時，所有菌株停止生長。綜上所述，本文的研究菌株BacillusmycoidesGnyt1 pH耐受性高，pH 4～9均能生長，最適的生長pH在6～7之間。

2.3 菌株最適溫度的測定

菌株適宜的生長環境溫度是決定菌株正常生長的關鍵因素之一。由圖3可知，在生長溫度為4℃時各菌株均未生長，在生長溫度為16℃時各菌株生長緩慢且生長速率不同，其中研究菌株BacillusmycoidesGnyt1生長速率最高。生長溫度至28℃時，各菌株生長速率均增長，其中以研究菌株BacillusmycoidesGnyt1生長最好。在生長溫度為34℃～40℃時，除研究菌株BacillusmycoidesGnyt1和對照菌株Pseudomonassp. Gm 92以外的菌株生長速率隨溫度的增高而降低，說明研究菌株BacillusmycoidesGnyt1具有很強的溫度耐受性。在溫度到達40℃以上，所有菌株的生長明顯受到抑制。綜上所述，研究菌株BacillusmycoidesGnyt1具有很強的溫度耐受性，8℃～40℃均能正常生長，但研究菌株BacillusmycoidesGnyt1的最適生長溫度為28℃～34℃。

圖3 菌株生長溫度曲線Fig.3 Strain growth temperature

2.4 菌株的溶磷能力

溶解無機磷的菌株，會伴隨生長不斷產酸，酸性環境下菌株能將無機磷溶解為有效磷。如圖4所示，五株菌株均具有溶磷能力，不同的菌株溶解無機磷的能力不同，菌株有效磷含量越高說明菌株的溶磷能力越高。其中菌株Bacillussubtilis89和研究菌株BacillusmycoidesGnyt1溶磷能力最好，有效磷含量分別為324.49 μg·mL-1和285.17 μg·mL-1，顯著高于菌株Pseudomonassp. Gm92和菌株Ensifermeliloti426 (P<0.05)，菌株Ensifermeliloti426的溶磷能力最低，有效磷含量為55.42 μg·mL-1。結果表明研究菌株BacillusmycoidesGnyt1溶磷能力較高，可繼續作為研究菌株深入研究溶磷機理和溶磷功能基因。

圖4 菌株的溶磷能力Fig.4 Phosphate dissolving ability of the strain注：不同小寫字母表示同一指標不同菌株表達量差異顯著(P<0.05)。下同Note:Different lowercase letters indicate that the expression levels of different strains of the same index are significantly different (P<0.05). The same as below

2.5 菌株的分泌植物激素能力

菌株BacillusmycoidesGnyt1和四株對照菌株Ensifermeliloti93,Pseudomonassp. Gm92,Ensifermeliloti426和Bacillussubtilis89保藏后的分泌植物激素的能力如圖5所示，五株菌株均有分泌植物激素IAA的能力，其中菌株Ensifermeliloti426、菌株Ensifermeliloti93和研究菌株BacillusmycoidesGnyt1分泌植物激素IAA能力較高，顯著高于菌株Pseudomonassp. Gm92和菌株Bacillussubtilis89 (P<0.05)，對照菌株Bacillussubtilis89的分泌植物激素IAA能力最低。結果表明研究菌株BacillusmycoidesGnyt1分泌植物激素IAA能力較高，能繼續作為研究菌株進行后續的深入研究。

圖5 菌株的分泌植物激素能力Fig.5 Strain producing ability of the strain

2.6 菌株的固氮能力

研究菌株BacillusmycoidesGnyt1和四株對照菌株保藏后的固氮酶活性如圖6所示，其中，研究菌株BacillusmycoidesGnyt1固氮酶活性最高，顯著高于其他四株對照菌株(P<0.05)，對照菌株Bacillussubtilis89次之，菌株Ensifermeliloti426固氮能力最低。結果表明研究菌株BacillusmycoidesGnyt1固氮能力最強，可繼續作為研究菌株深入研究固氮機理和固氮功能基因。

圖6 菌株固氮酶活性Fig.6 Strain nitrogenase activity

3 討論

生長速率高、培養溫度適中、培養條件便于調控、pH適中及生物安全性高、穩定性高的菌株可進行開發利用[17-18]。保藏前菌株BacillusmycoidesGnyt1最適生長溫度為28℃～36℃，最適pH為7～8，增殖速度快，其溶磷能力、分泌植物激素能力及固氮能力相比課題組前期研究積累的優良菌株更為突出[15,19]。本研究表明，與菌株BacillusmycoidesGnyt1保藏前的特性以及和課題組積累的優良對照菌株相比，菌株BacillusmycoidesGnyt1保藏后生長動態、最適pH及最適溫度均無明顯變化，研究菌株能高效的溶解無機磷，固氮能力最高且分泌植物激素(IAA)的能力較強，特性穩定性高，綜合評價表明菌株BacillusmycoidesGnyt1仍為優良促生菌株，可以進一步開發利用和深入研究。研究菌株BacillusmycoidesGnyt1的高穩定性，可能與菌株宿主植物生長在高寒環境有關，能抵抗環境的變化[20]。適宜的菌株保藏可以促進優良菌株資源庫的發展，且特性突出的菌株遺傳穩定性較高，傳代培養或保藏后退化不明顯，不影響菌株的開發利用，這一結果與胡江春研究中的結果相似[21]。對植物促生菌的功能進行研究，必須要對比測定特性的變化，保證后期研究材料的正確性和有效性。因此，植物促生菌的生長動態、pH值、溫度以及突出特性的研究對選育菌株和保藏菌株均有重要的評價作用。

優良植物根際促生菌通常具有溶磷、固氮或分泌植物激素的一種或多種突出生物功能[24]，溶磷菌不代表只能溶磷，可能也有固氮功能[22]，其中測定菌株固氮酶活性的高低是確認菌株固氮能力的傳統方法，能直接反映菌株固氮能力強弱[23]，菌株傳代保藏使菌株固氮能力產生些許退化屬于正常現象。因此，選育良好的多功能菌株，必須要全方面衡量菌株，合理的保藏菌株對后期研究頗為重要，能評價菌株的后續可利用性及保藏方法的可行性[25-26]。本研究菌株BacillusmycoidesGnyt1使用低溫冷凍斜面保藏方法，保藏后菌株BacillusmycoidesGnyt1的溶磷能力、固氮能力和分泌植物激素能力均較高，說明低溫冷凍斜面保藏的方法可行，但此方法不適合長期保藏。菌株保藏的方式多種，而適合細菌科學有效的保存方法有低溫冷凍斜面保藏和甘油冷凍保藏，甘油冷凍保藏適合多年及以上的長期細菌菌株的保藏，短期及菌株的活化多用低溫冷凍斜面保藏方法[27-30]。

植物根際促生菌因其優良的生物學特性，成為近年來研究的熱點[31-32]。菌株的溶磷能力、分泌植物激素能力和固氮能力會隨菌株的生長時間而發生一定程度的降低，降低程度的大小根據菌株的類型、生長時間和保藏方法的差異而不同[33]。菌株的長期有效利用需對比其他優良促生菌的生物學特性，通過比較確定菌株的優勢[34]，決定是否有后期利用的潛力。本研究選取菌株BacillusmycoidesGnyt1保藏前測定生物性能的對照菌株及同類型的優良菌株作為對照菌株，綜合比較研究菌株和對照菌株的生物性能，其中研究菌株BacillusmycoidesGnyt1的溶磷能力、分泌植物激素能力及固氮能力均顯著高于4株對照菌株，其功能豐富、特性優良，仍為優良菌株，這與菌株BacillusmycoidesGnyt1保藏前相比對照菌株測定生物性能的結果一致[15]，保證了后期研究選擇該菌株的可靠性和合理性。比較保藏前后的菌株BacillusmycoidesGnyt1的生物學特性，除菌株生長動態、最適pH及最適溫度無變化外，菌株BacillusmycoidesGnyt1的溶磷能力、分泌植物激素能力及固氮能力降低均不顯著，符合菌株保藏的降低范圍，這與秦婷婷等[35]的微生物保藏研究結論一致，合理適宜的菌株保藏方法能避免不良因素的影響，能使優良菌株的特性穩定保存，可提供優良穩定的菌株供后期分子生物學等研究的研究材料。

4 結論

本研究將保藏兩年后的菌株BacillusmycoidesGnyt1與四株優良植物促生菌進行比較，結果表明研究菌株BacillusmycoidesGnyt1特性穩定性較高，增殖速度最快，活菌濃度最高，對環境pH有很強耐受性，最適pH值在6～7之間，對環境溫度耐受性高，最適生長溫度為28℃～34℃。其溶磷能力、固氮能力及分泌生長激素的能力均較強，保藏兩年后仍可繼續作為研究菌株深入研究其功能機理和功能基因。