疊氮化鈉誘變燕麥M1代的主要性狀分析

藺豆豆， 趙桂琴， 柴繼寬， 宮文龍， 蘇瑋娟， 張麗睿

(甘肅農業大學草業學院， 草業生態系統教育部重點實驗室， 甘肅省草業工程實驗室， 中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730000)

燕麥(Avenasativa)為禾本科燕麥屬一年生草本植物，在世界范圍內廣泛栽培[1-2]。燕麥在我國種植歷史悠久，但目前普遍存在品種單一、同質化嚴重等問題，無法滿足生產發展對多樣化品種的需求[3-5]。因此，通過各種手段創制新種質、加速品種選育迫在眉睫。

化學誘變是種質創新的有效途徑之一[6]。相對于自然變異、人工雜交、基因工程等方法，化學誘變耗時較短、操作簡單、成本較低且能產生較多突變類型，在種質創新及解決某些育種問題上具有獨特作用[7-8]。常用的化學誘變劑主要有甲基磺酸乙酯(Ethyl methyl sulfonate，EMS)、疊氮化鈉(Sodium azide，NaN3)和N-甲基-N-亞硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)等[9]。其中，NaN3是疊氮化物中最具代表性的化學誘變劑。NaN3處理能夠產生大范圍的點突變，且染色體畸變率較低，是一種高效、安全、價格低廉的化學誘變劑[10]。Spence于1965年首次報道了NaN3的誘變效應，此后，NaN3在動植物等多個領域中得到了廣泛應用[11-12]。

NaN3處理會對植物種子胚造成不同程度的損傷，使得植物在誘變一代(M1)就發生廣泛變異。半致死劑量被認為是誘導突變的最佳劑量[13]，但由于化學誘變的不定向性，在半致死劑量處理下不一定能夠獲得目標突變體。董文科等[14]設置了6個EMS濃度和3個處理時間對多年生黑麥草進行誘變處理，并使用30%的PEG-6000溶液對M1代的所有單株進行抗旱性篩選，最終獲得來自不同EMS處理的15株抗性植株，其中3個抗旱性較強的變異株也并不全部來自半致死劑量處理。同樣，Colasuonno等人[15]在0.70%～0.85%范圍內設置4個EMS濃度分別處理小麥種子，成功獲得了2個穩定的類胡蘿卜素突變體。但4個處理下M1代致死率均高于半致死劑量，其致死率高達76.4%～88.7%。Konzak[16]等發現，在其他條件相同的情況下，隨著NaN3濃度由0.5 mM升至2.5 mM，大麥(Hordeumvulgare)葉綠素突變體出現的頻率不斷增加。NaN3處理顯著抑制了小麥(Triticumaestivum) M1代的出苗率，隨著其濃度由20 mg·L-1增至120 mg·L-1，M1代變異率不斷增加，變異類型非常豐富[17]。由此可見，NaN3處理會使植物發生大幅度變異，不同劑量下出現的突變體類型及其頻率也不盡相同，若要獲得盡可能多的突變體，就不能僅僅局限于半致死劑量。

目前，國內有關NaN3誘變的研究主要集中在小麥、大麥、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)等作物上[18-23]，有關NaN3誘變燕麥的研究還未見報道，NaN3處理后燕麥M1代各農藝性狀的變化情況也不得而知。鑒于此，本試驗擬用NaN3處理燕麥種子，測定M1代的田間主要性狀，分析各指標的變化情況，以期為構建燕麥NaN3突變體庫提供理論依據和基礎材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試燕麥品種為‘愛沃’(‘Everleaf’)和‘青永久709’(‘Qingyongjiu 709’)，均由甘肅農業大學草業學院提供。

1.2 試驗設計

1.2.1試驗地概況 本試驗在甘肅農業大學牧草試驗站進行，該站位于蘭州市西北部，地處黃土高原西端，海拔1 473.6 m，全年無霜期90 d～210 d；年均溫11℃，年平均降水量為350～400 mm，主要集中在6—9月。土壤有機質含量8.80 g·kg-1、速效氮含量42.88 mg·kg-1、速效磷含量35.72 mg·kg-1、速效鉀含量177.19 mg·kg-1、土壤pH值7.71。

1.2.2NaN3處理 試驗設置4個NaN3濃度梯度(0，5，10，15 mM)，每個濃度分別處理3個時間(1，2，3 h)，共12個處理，3次重復，以0 mM下各時間處理作為相應的對照。每重復取200粒大小一致、籽粒飽滿的燕麥種子放入玻璃杯中，加蒸餾水淹沒種子，置于4℃冰箱，充分吸脹14 h。取出后室溫放置4 h，瀝干水分，加入100 mL磷酸緩沖液。之后依次加入0，1.0，1.5，2.0 mL的NaN3母液，使其濃度為0，5，10，15 mM。置于智能恒溫培養振蕩器中，在25℃,150 r·min-1條件分別震蕩處理1，2，3 h。取下后倒出藥液，流水沖洗2 h，瀝干水分，置于4℃冰箱12 h后準備播種。

1.2.3M1代的種植 將各處理種子按照濃度梯度點播至大田，播前施足底肥，株距0.1 m，行距0.3 m，播深4～5 cm。分別于分蘗期、拔節期、開花期、灌漿期各灌水一次，在分蘗期后、拔節期前中耕除草一次。

1.3 測定指標及方法

各指標測定方法參考《燕麥種質資源描述規范和數據標準》[24]。

株高：灌漿期用卷尺測量植株從地面到莖尖的垂直距離。

旗葉長：灌漿期用厘米刻度尺測量旗葉葉尖至旗葉基部的距離。

旗葉寬：灌漿期用厘米刻度尺測量旗葉最寬部分的距離。

旗葉面積：0.73 (矯正系數)×旗葉長×旗葉寬[25]。

有效分蘗數：成熟期測定單株的有效分蘗數。

主穗粒數：計數單株的主穗粒數。

主穗粒重：待風干后分別對單株的主穗進行脫粒，用天平稱取單株的主穗粒重。

生育期：出苗至成熟的歷時天數。

1.4 數據分析

利用Microsoft Excel 2010和SPSS 25.0軟件進行方差分析和顯著性檢驗，利用Duncan氏新復極差法進行多重比較，使用Origin軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 NaN3處理對燕麥M1代植株生長發育的影響

2.1.1M1代生育期的變化情況 由表1可知，在不加NaN3的情況下，‘愛沃’的生育期為92 d，‘青永久709’的為80 d。經NaN3處理后，‘愛沃’和‘青永久709’的M1代分別在10 mM/2 h和10 mM/1 h處理下達到最長生育期，分別為95 d和83 d；‘愛沃’在5 mM/2 h，10 mM/1 h處理下生育期最短(89 d)，‘青永久709’則在5 mM/3 h達到最短生育期(77 d)。生育期的變化主要是由出苗、抽穗和成熟期的不同引起的。NaN3處理后燕麥M1代的出苗期較對照延遲了2～5 d。與對照相比，在低濃度(5 mM)下，M1代進入分蘗期和拔節期的時間基本不變，而在中、高濃度下則會出現提前或延遲1～3 d的情況。除5 mM/3 h和10 mM/2 h處理(分別較對照提前1 d～2 d)外，‘愛沃’的M1代在大部分處理下抽穗期延遲2～3 d?！嘤谰?09’的M1代在10 mM/1 h和10 mM/3 h處理下抽穗期較對照延遲4 d。此外，燕麥M1代在中、高濃度NaN3處理下成熟期最長推遲了5 d。

表1 NaN3誘變燕麥M1代生育期變化情況Table 1 Changes in the growth period of the M1 generation of oats induced by NaN3

2.1.2M1代植株性狀的變化 對NaN3處理后燕麥M1代的各指標進行聯合方差分析可知，NaN3濃度是引起各指標(主穗粒重除外)產生差異的最主要因素，其次為時間，品種的影響最小。品種×時間的交互作用對有效分蘗數無顯著影響；除此之外，品種、濃度和時間及其兩兩交互和三者的互作均對株高、旗葉長、旗葉寬、旗葉面積、主穗粒數、主穗粒重均有極顯著影響(P<0.01)。

表2 NaN3處理對燕麥M1代植株性狀影響的方差分析Table 2 Variance analysis on agronomic traits of oat M1 under NaN3 treatment

經NaN3處理后，M1代的株高均低于相應對照，且隨NaN3濃度的升高、處理時間的延長降幅逐漸增大。但旗葉長和旗葉寬的變化有所不同。高濃度NaN3處理下‘愛沃’和‘青永久709’的M1代旗葉長分別下降了9.84%和7.06%，旗葉寬平均增幅分別為2.23%和15.07%。M1代旗葉面積的變化有所不同，‘青永久709’ 的M1代旗葉面積總體大于對照且在15 mM/2 h處理下達到最大(42.95 cm2)；‘愛沃’的M1代旗葉面積在低、中濃度下呈增加趨勢，但在高濃度處理卻較對照下降了7.23%。NaN3處理使得‘青永久709’的M1代有效分蘗數較對照明顯增加，低濃度處理下增幅即達30.05%；而‘愛沃’的僅在10 mM/1 h和10 mM/2 h處理下有所增加(分別為8.33%和14.81%)，其余處理下均低于對照。主穗粒數隨處理濃度的增加和時間的延長總體呈下降趨勢，但主穗粒重的變化則有所不同?！異畚帧腗1代主穗粒重高于對照(低濃度1 h，2 h除外)，在10 mM/1 h處理下增幅達119.05%，即使在15 mM/3 h處理下仍較對照增加了3.57%。‘青永久709’的M1代主穗粒重在高濃度(15 mM)下較對照平均降低了26.38%。

通過計算不同NaN3處理下M1代各指標的變異系數可知(表3)，除‘愛沃’的有效分蘗數以外，其余指標的變異程度總體隨NaN3濃度的升高、處理時間的延長而逐漸加大；其中主穗粒重的變幅最大，最高CV值分別為87.92%(‘愛沃’)和90.80%(‘青永久709’)；而旗葉長和旗葉寬的變幅相對較小，變幅最小的是株高，‘愛沃’和‘青永久709’的M1代株高的最大CV值分別為6.39%和7.62%。另外，同一指標在兩品種間的變化情況各不相同。盡管兩品種的對照在各指標上的變化較小(CV<14%)，但NaN3處理后兩品種燕麥M1代的各指標均發生了明顯變化?！異畚帧腗1代旗葉寬(CV:7.80%～30.72%)和有效分蘗數(CV:8.33%～80.28%)的變幅大于‘青永久709’(CV:7.16%～23.34%和7.33%～58.79%)。除此之外，其余指標的變化幅度均為‘青永久709’大于‘愛沃’。

表3 不同NaN3處理下燕麥M1代各指標的平均值及變異系數Table 3 Average value and coefficient of variation of each index of oat M1 generation under different NaN3treatments

2.2 不同NaN3處理下燕麥M1代植株各指標間的主成分分析(Principal component analysis，PCA)

基于株高等7個性狀指標，對9個不同NaN3處理組合下燕麥的M1代植株進行PCA分析(圖1)。基于PC1可將M1代植株劃分為彼此獨立的兩大類群，即對照所在的A類群(A-1和A-2)和經NaN3處理后M1代群體所在的B類群(B-1和B-2)。雖然PC2并未將兩大類群進一步劃分，但兩品種及其M1群體還是分別位于4個不同的亞群中。其中，‘愛沃’對照所在的A-1亞群與‘青永久709’對照所在的A-2亞群彼此分離、互不影響；而B-1和B-2兩個亞群不能完全獨立。但相較于B-1亞群，B-2亞群表現出更大的離散程度。說明‘青永久709’的M1代群體在7個指標上的差異更明顯，個體間的變化程度更大。

圖1 燕麥M1代性狀的PCA分析Fig.1 PCA analysis of oats M1 traits注：A-1表示‘愛沃’對照；A-2表示‘青永久709’對照；B-1表示‘愛沃’不同處理；B-2表示‘青永久709’不同處理Note:A-1 indicate ‘Everleaf’ control;A-2 indicate ‘Qingyongjiu 709’ control;B-1 indicate ‘Everleaf’ different treatments;B-2 indicate ‘Qingyongjiu 709’ different treatments

3 討論

NaN3是一種具有誘變作用的無機鹽，在酸性環境下，NaN3會產生HN3分子，HN3進入細胞會抑制細胞的呼吸作用以及ATP的形成[26]，造成DNA分子發生堿基替換，誘發點突變[27]。經NaN3處理后，燕麥M1代植株的生長發育受到顯著影響，出苗期、抽穗期以及成熟期均較對照明顯延后。有研究報道，經NaN3處理后的小麥種子在大田播種后出苗較正常種子推遲4～5 d，麥苗明顯細弱，生長緩慢[28]。這可是由于NaN3處理使得植物細胞供能受到抑制，從而影響了幼苗生長[29]。

葉片是植物進行光合作用的主要器官，葉片大小的變化反映了植物在光合能力最大化與逆境適應間的權衡[30]。在本研究中，NaN3處理后燕麥M1代植株的旗葉長較對照下降，旗葉寬卻較對照增加，導致旗葉面積發生了變化，進而影響了光合產物的積累。這與陳燦[30]在水稻上的研究結果一致。但與之不同的是，陳燦的研究結果表明化學誘變劑對水稻的生長表現出“抑高促蘗”的效應，即抑制了株高而促進了分蘗。但本研究中，NaN3處理后‘青永久709’的M1代株高下降，有效分蘗增加，而‘愛沃’在株高下降的同時有效分蘗數也大多低于相應對照，原因可能是‘愛沃’旗葉面積下降，降低了光合產物的積累[31-32]。有研究表明，NaN3對植物的影響與逆境相似，會對植物體內赤霉素、生長素等相關激素的合成與分解產生影響[26]，從而調控植物的株高及分蘗[33]。分蘗是谷類作物最重要的農藝性狀之一，對單株小穗數或穗粒數起決定性作用[34]。經NaN3處理后燕麥M1代植株的主穗粒數較對照有所減少，但主穗粒重增加。而在李衛華[35]的研究中，小麥M1代的分蘗數隨誘變劑濃度的升高表現出“先升后降”的變化趨勢，主穗粒數和主穗粒重均明顯下降。原因可能是所用化學誘變劑不同，對植物造成的效應也有所不同；另外，不同物種對誘變劑的響應也不盡相同。

變異系數可以反映植物某一指標的變異程度，在一定程度上可以說明該指標的遺傳變異水平[36]。在本研究中，各處理下M1代的株高和旗葉長的變異系數較小，而有效分蘗數、旗葉面積、主穗粒數和主穗粒重的變異系數較大，其中主穗粒重的變異系數最大(‘愛沃’的為87.92%；‘青永久709’的為98.27%)，這與張容[34]在小麥上的研究結果一致。M1代植株的旗葉寬以及旗葉面積也發生了不同程度的變化，除旗葉寬和有效分蘗數外，其余各指標的變幅均為‘青永久709’大于‘愛沃’。表明不同基因型對同一化學誘變劑的敏感性不同[37]?；?個指標的PCA分析，將供試材料劃分為4個亞群，其中M1代所在的B-1和B-2兩個亞群并不能完全獨立，體現了NaN3處理后兩品種某些指標變化的一致性。而變異系數則體現了不同指標對NaN3的反應程度。另外，本研究結果顯示PC1與PC2之和為31.4%，相對較小。說明在前兩個主成分下，7個指標并不能充分解釋M1代個體間差異。這可能是由于化學誘變劑對植物產生的誘變效應是隨機的，有的變異在M1代只是暫時的生理失調；NaN3處理還可能誘發燕麥產生其他變異，而這類變異在M1代尚未表現出來[38]。總體而言，‘青永久709’的M1代個體間差異更大，可能更有利于后代突變體的篩選。

隨著化學誘變劑濃度的增加以及誘變時間的延長，誘變劑的滲透程度逐漸加大，對植物的效應也隨之加劇[39]。M1代各性狀的變幅總體隨NaN3濃度的升高及處理時間的延長而增大。NaN3濃度越高，后代性狀的變化幅度越大，突變類型可能越多。有研究表明，在一定濃度范圍內，植物抵御NaN3脅迫的能力會隨其濃度升高而逐漸增加，但濃度過高又會打破機體的代謝平衡，毒害作用加劇，死亡率過高，導致誘變后代群體數量減小，不利于突變體的篩選[40]。另外，NaN3處理下各指標的變化幅度明顯不同，如‘愛沃’的M1代有效分蘗數在低濃度、短時間(5 mM/1 h)內變異系數就高達80.28%。因此，在何種處理下能獲得最大的變異群體，也因具體材料而異。

4 結論

NaN3處理顯著影響了燕麥M1代植株的生長，使其生育期推遲、株高降低，有效分蘗數、旗葉面積、主穗粒數和主穗粒重均發生了顯著變化，且隨NaN3濃度的升高和處理時間的延長，變幅逐漸增大。相較于‘愛沃’，‘青永久709’對NaN3處理反應更敏感，其M1代各指標的變幅更大。