干旱脅迫時間對6份飼用燕麥種質萌發期生理指標的影響

蘇瑋娟， 趙桂琴， 琚澤亮， 宮文龍， 柴繼寬

(甘肅農業大學草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心， 甘肅 蘭州 730070)

飼用燕麥(AvenasativaL.)又稱皮燕麥，是禾本科燕麥屬一年生糧飼兼用作物[1]，具有較強的適應性[2]，主要栽培于我國北方地區[3]。隨著全球氣候變暖，干旱成為該地區燕麥生產面臨的嚴重問題之一[4]。干旱脅迫會導致植物細胞膜脂過氧化，影響植株正常生長發育，降低植株產量和品質[5]。因此，研究燕麥對干旱脅迫的生理響應、篩選耐旱性強的品種成為這類地區提高飼草產量和品質、促進產業發展的有效途徑[6]。張娜等[7]研究發現，在干旱脅迫下，燕麥幼苗葉片的過氧化酶活性顯著升高，當細胞膜脂過氧化水平較低時，細胞內的保護酶可有效清除活性氧自由基，從而減輕干旱脅迫造成的傷害，而當膜脂過氧化水平進一步升高時，細胞膜透性增大，膜結構發生變化甚至受損。劉景輝等[8]對燕麥各個生育期的葉片滲透調節物質研究后發現，干旱脅迫下燕麥的脯氨酸(Proline，Pro)和可溶性蛋白(Soluble protein，SP)含量均顯著增加。Lawlor[9]發現，干旱脅迫可導致燕麥的可溶性蛋白含量下降，細胞保水能力減弱，植株出現萎焉現象。

對植物萌發期耐旱性研究常采用聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG-6000)、甘露醇等高滲溶液模擬干旱脅迫的方法[10]。PEG可使滲透壓保持穩定，具有不易被植物吸收、無毒等特點，常作為滲透脅迫劑[11]，在玉米(ZeamaysL.)[12-13]、小麥(TriticumaestivumL.)[14-15]等作物的耐旱性研究方面廣泛應用。羅興雨等[16]發現，15% PEG脅迫使燕麥幼苗受到中度傷害，但燕麥不會在短時間內死亡，因而可將15% PEG作為模擬干旱脅迫的適宜濃度。

植物對干旱脅迫的響應是一個動態過程，影響其受損情況的除了脅迫強度外，更重要的是脅迫時間的長短[17]。王力偉等[18]研究發現，干旱脅迫下燕麥幼苗的Pro含量和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性隨脅迫時間的延長呈先升后降的變化趨勢，脅迫48 h時Pro含量和SOD活性達到峰值。持續干旱脅迫 10 d，黑麥草(LoliumperenneL.)的SOD活性達到峰值，抗氧化酶活性較高[19]。雖有研究報道了植物各項生理指標變化與逆境脅迫時間之間的關系[20-22]，但不同發育階段、不同脅迫時間下植物對干旱脅迫的生理響應有所不同，萌發期是植物適應干旱脅迫的第一階段、也是最為關鍵的時期，影響著植物立苗和后期的生長發育[23]。目前關于燕麥苗期耐旱性的研究已有報道[24-25]，但對萌發期不同脅迫時間下其生理生化變化的研究并不多見，而且不同供試材料在同一脅迫條件下的響應也不盡相同。因此本試驗擬采用15%PEG模擬干旱脅迫，對6份燕麥材料萌發期滲透調節、保護酶活性等的變化動態進行研究，并利用主成分及隸屬函數法對其耐旱性進行評價為揭示燕麥對干旱脅迫的生理響應和篩選耐旱品種提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

6份供試燕麥材料分別為‘蒙燕1號’、‘青引1號’、‘定燕2號’、‘DA92-2F4’、‘加燕2號’和‘甜燕麥’，均由甘肅農業大學草業學院提供。

1.2 試驗設計

選擇大小均勻一致的燕麥種子，用75%乙醇浸泡1 min消毒后用蒸餾水沖洗干凈，進行催芽。選露白一致的種子播種在裝有珍珠巖與石英砂(1∶1)的育苗杯(直徑10 cm，高16 cm)中，每杯15粒，澆足水后將育苗杯置于白色塑料方盒(35 cm×25 cm×15 cm)中，每盒6杯，置于生長室(晝/夜溫度25℃/18℃，相對濕度65% ～ 75%，光照強度500 ～ 700 μmol·m-2·s-1)培養。以胚芽長度≥1/2種子長度、胚根長度≥種子長度為發芽標準[18]，以第1粒種子的發芽日期開始計時，待發芽后第4 d對各品種進行15% PEG處理，以不加PEG為對照，于0，24，48，72和96 h采樣測定生理指標，每個處理4次重復。

1.3 測定指標和方法

1.3.1丙二醛 丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸方法測定[26]。

1.3.2滲透調節物質 可溶性糖(Soluble sugar，SS)含量采用蒽酮比色法測定[26]，可溶性蛋白采用考馬斯亮藍法測定[26]，脯氨酸含量采用磺基水楊酸方法測定[26]。

1.3.3抗氧化酶系統 SOD活性用氮藍四唑法測定[26]，過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性采用愈創木酚法[26]，過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性采用紫外吸收法測定[26]。

1.4 耐旱性綜合評價

對萌發期6份燕麥材料進行相關性分析后，根據主成分分析法[27]將測定的7項生理指標進行降維，并篩選出耐旱性綜合指標，最后利用隸屬函數法[27]進行耐旱性評價。

1.4.1各材料綜合指標隸屬函數值 當材料的耐旱性與所測指標正相關時，其綜合隸屬函數計算公式為：

U(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)j=1，2，3，…，n

(1)

當材料的耐旱性與所測指標負相關時，其綜合隸屬函數計算公式為：

U(Xj)=1-(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)j=1，2，3，…，n

(2)

式中：Xj表示第j個綜合指標；Xmin表示j第個綜合指標最小值；Xmax表示第j個綜合指標最大值。

1.4.2各材料綜合指標權重

(3)

式中：Wj表示第j個綜合指標在所有綜合指標中重要程度即權重；Pj為各基因型第j個綜合指標貢獻率。

1.4.3各材料耐旱性綜合評價

(4)

式中：D值為各指標的耐旱性綜合評價值。

1.5 數據統計與分析

采用Microsoft Excel 2010對數據進行統計，使用SPSS 20.0 軟件對數據進行單因素方差分析，利用主成分分析法、隸屬函數法對6個燕麥材料的耐旱性進行評價。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫時間對燕麥丙二醛(MDA)含量的影響

干旱脅迫對燕麥萌發期MDA含量有顯著影響。隨脅迫時間的延長，MDA含量總體呈上升趨勢，脅迫96 h后MDA含量與對照(0 h)相比顯著增加(P<0.05)，但不同材料的變化動態明顯不同。由表1可知，‘甜燕麥’的MDA含量隨脅迫時間的延長逐漸增加，96 h達到最大值(9.61 μmol·g-1)，而其余材料均隨脅迫時間的延長呈先上升后降低的變化趨勢。干旱脅迫24 h，‘DA92-2F4’的MDA含量達到最大值，較對照增加了209.38%，隨后其MDA含量穩步下降，96 h時降至12.06 μmol·g-1。而‘青引1號’和‘蒙燕1號’的MDA含量在脅迫48 h時達到峰值(分別為23.78和22.56 μmol·g-1)。‘定燕2號’和‘加燕2號’在干旱脅迫72 h時MDA含量達到最大，較對照增加77.66%和255.59%。

由表1可知，供試材料在未進行干旱脅迫時(0 h)，MDA含量就有顯著差異，其中‘青引1號’和‘定燕2號’的較高，其次是‘蒙燕1號’、‘DA92-2F4’和‘加燕2號’，‘甜燕麥’的含量較低。干旱脅迫后6份材料的MDA含量不僅達到峰值的時間點不同，而且其峰值之間差異也非常顯著，‘青引1號’的最高，為23.78 μmol·g-1，‘甜燕麥’的峰值則最低(9.61 μmol·g-1)，較前者低59.59%。

表1 干旱脅迫時間對供試燕麥丙二醛含量的影響Table 1 Effect of drought stress time on MDA content of oats 單位：μmol·g-1

2.2 干旱脅迫時間對燕麥滲透調節特性的影響

2.2.1干旱脅迫時間對燕麥萌發期可溶性糖含量的影響 干旱脅迫顯著影響了燕麥可溶性糖含量的變化。由表2可知，未進行干旱脅迫時(0 h)，6份材料的可溶性糖含量無顯著差異。隨脅迫時間的延長，可溶性糖含量總體呈上升趨勢，在脅迫72 h時達到峰值，這時‘青引1號’和‘定燕2號’的可溶性糖含量較高(分別為7.36和7.30 mg·g-1，P<0.05)，‘甜燕麥’的含量最低(4.28 mg·g-1)。隨著脅迫時間的進一步延長，可溶性糖含量有所下降，脅迫96 h時‘蒙燕1號’和‘青引1號’的可溶性糖含量較72 h時分別下降了11.64%和15.08%；‘加燕2號’和‘甜燕麥’降幅最小，分別為1.47%和2.80%，但‘甜燕麥’的含量仍然最低。

表2 干旱脅迫時間對供試燕麥可溶性糖含量的影響Table 2 Effect of drought stress time on soluble sugar content of oats 單位：mg·g-1

2.2.2干旱脅迫時間對燕麥脯氨酸含量的影響 隨脅迫時間的延長，燕麥的脯氨酸含量總體呈上升趨勢，但各材料的脯氨酸含量在不同時間點的變化明顯不同(P<0.05)。由表3可知，‘甜燕麥’和‘定燕2號’的脯氨酸含量隨脅迫時間延長穩步上升，在96 h達到最大(601.03 mg·g-1和433.53 mg·g-1)，而其余材料均隨脅迫時間的延長呈先升后降的變化趨勢。干旱脅迫48 h時，‘DA92-2F4’，‘蒙燕1號’和‘青引1號’的脯氨酸含量達最大值(分別為434.70 mg·g-1、229.20 mg·g-1和310.13 mg·g-1)，而‘加燕2號’的脯氨酸含量在脅迫72 h時才達到峰值，較對照增加847.21%。

表3 干旱脅迫時間對供試燕麥脯氨酸(Pro)含量的影響Table 3 Effect of drought stress time on proline (Pro) content of oats 單位：mg·g-1

另外，在干旱脅迫前(0 h)各材料的脯氨酸含量就存在顯著差異(P<0.05)，‘甜燕麥’和‘DA92-2F4’的脯氨酸含量較高(224.83和213.30 mg·g-1)，‘加燕2號’的最低(22.90 mg·g-1)。干旱脅迫后，6份材料的脯氨酸含量達到峰值的時間點不同，且其峰值之間也差異顯著，‘甜燕麥’的最高，‘加燕2號’的最低。

2.2.3干旱脅迫時間下對燕麥可溶性蛋白含量的影響 由表4可知，干旱脅迫處理前‘甜燕麥’的可溶性蛋白含量最高，‘DA92-2F4’的最低。干旱脅迫增加了燕麥的可溶性蛋白含量，但不同材料的變化動態各異。脅迫48 h時‘DA92-2F4’的可溶性蛋白含量即達到最大(41.07 mg·g-1)，隨后迅速下降，至96 h時降至20.57 mg·g-1。‘加燕2號’的可溶性蛋白含量在脅迫24 h時即顯著高于其他材料，在72 h時達到峰值(38.80 mg·g-1)，隨后無明顯變化，96 h時仍為所有材料中最高(P<0.05)。‘甜燕麥’的可溶性蛋白在干旱脅迫下最高為26.83 mg·g-1，較對照增加了7.88%。

表4 干旱脅迫時間對供試燕麥可溶性蛋白含量的變化Table 4 Effect of drought stress time on soluble protein content of oats 單位：mg·g-1

2.3 干旱脅迫時間對燕麥抗氧化特性的影響

2.3.1干旱脅迫時間對燕麥SOD活性的影響 隨脅迫時間的延長，燕麥SOD活性總體呈上升趨勢，脅迫96 h后SOD活性高于對照(0 h)，但各材料的變化不盡相同。由圖1可知，‘甜燕麥’的SOD活性在干旱脅迫96 h達到最大值(168.73 U·g-1)，且顯著高于其他材料(P<0.05)，而其余材料的SOD活性均隨脅迫時間的延長呈先上升后降低的變化趨勢。‘DA92-2F4’和‘加燕2號’在脅迫48 h時SOD活性達到最大，分別較對照顯著增加88.76%和49.93%。‘青引1號’和‘定燕2號’的SOD活性在72 h時達到峰值(123.13和122.83 U·g-1)，但其增長幅度相對較小，分別比對照增加38.77%和38.63%。

如圖1所示，6份材料在處理前(0 h)，其SOD活性便存在顯著差異(P<0.05)，其中‘加燕2號’的SOD活性最高(109.83 U·g-1)，‘定燕2號’的最低(88.60 U·g-1)。干旱脅迫后各材料的SOD活性不僅增幅不一，且其峰值之間也存在顯著差異，‘DA92-2F4’峰值最高，‘定燕2號’的峰值最低。

圖1 干旱脅迫時間對供試燕麥SOD酶活性的變化Fig.1 Effect of drought stress time on SOD activity of oats

2.3.2干旱脅迫時間對燕麥POD活性的影響 由圖2可知，脅迫96 h后各材料的POD活性較對照(0 h)顯著增加。隨脅迫時間的延長，POD活性總體呈上升趨勢，但供試材料間差異顯著。‘DA92-2F4’的POD活性在干旱脅迫24 h時達到最大(81.60 U·min-1·g-1)，隨后急劇下降，96 h時降至37.57 U·min-1·g-1，顯著低于其他材料(P<0.05)。‘蒙燕1號’和‘青引1號’的POD活性在脅迫48 h達到最大，較對照分別增加237.64%和202.13%。‘甜燕麥’則在72 h時POD活性達到最大(44.40 U·min-1·g-1)。另外，干旱脅迫之前各材料的POD活性差異不大，但脅迫后其POD活性不僅達到峰值的時間點不同，而且峰值之間差異顯著。

圖2 干旱脅迫時間對供試燕麥POD酶活性的變化Fig.2 Effect of drought stress time on POD activity of oats

2.3.3干旱脅迫時間對燕麥的CAT活性的影響 6份材料的CAT活性隨脅迫時間的延長總體呈上升趨勢。由圖3可知，脅迫96 h后各材料的CAT活性高于對照(0 h)，但不同材料的CAT活性變化存在顯著差異。‘DA92-2F4’在脅迫24 h時CAT活性達到最大(86.98 U·mol-1·g-1)，但96 h時其CAT值僅為50.83 U·mol-1·g-1，顯著低于其他材料(P<0.05)。‘加燕2號’和‘甜燕麥’在脅迫72 h時CAT活性達到峰值，分別比對照增加32.49%和31.04%。另外，干旱脅迫前各材料的CAT活性就有顯著差異(P<0.05)，其中‘加燕2號’的最高(52.72 U·mol-1·g-1)，‘定燕2號’的最低(41.33 U·mol-1·g-1)。干旱脅迫后6份材料的CAT活性分別在不同時間點達到峰值，其中‘DA92-2F4’的最高(86.98 U·mol-1·g-1，24 h)，其次為‘蒙燕1號’(71.88 U·mol-1·g-1，72 h)，‘青引1號’的峰值最低(67.75 U·mol-1·g-1,24 h)。

圖3 干旱脅迫時間對供試燕麥CAT酶活性的變化Fig.3 Effect of drought stress time on CAT activity of oats

2.4 不同燕麥材料萌發期耐旱性評價

2.4.1干旱脅迫下各生理指標間的相關性分析 為了了解各生理生化指標間的關聯程度[28]，對滲透調節物質、抗氧化特性和膜脂過氧化的7個單項指標進行相關性分析(表5)，發現Pro含量與POD，CAT活性呈顯著正相關關系(P<0.05)，相關系數分別為0.632和0.693，且POD活性與CAT活性呈極顯著正相關關系(0.732，P<0.01)。MDA含量與Pro含量、POD和CAT活性極顯著負相關(P<0.01)，相關系數分別為—0.668，—0.893和—0.668。SP含量與SOD活性顯著正相關(P<0.05)，SS含量與POD活性也呈顯著正相關關系(P<0.05)。因此，僅采用單一或個別幾個指標來評價燕麥萌發期的耐旱性不太可靠，應對其進行綜合分析。

表5 6份燕麥材料各指標間的相關性分析Table 5 Correlation analysis of various indicators of 6 forage oats under drught stress

2.4.26份燕麥材料各指標間的主成分分析 相關性分析表明，各指標間存在一定的信息重疊現象，因此采用主成分對表6中的7項指標進一步分析，結果表明，前3個綜合指標的主成分貢獻率分別為55.945%，24.934%和13.328%，累計貢獻率達94.207%(表6)。綜合各指標系數發現，主成分1中MDA含量、SS含量和POD活性的系數較高，分別為0.921，0.953和0.925，這3個系數可作為判斷燕麥受到干旱脅迫后膜脂過氧化變化的依據；主成分2中SP含量、SOD活性、CAT活性和主成分3中SOD活性的系數較大，分別為0.760，0.566，0.385和0.553，反映出燕麥在干旱脅迫條件下滲透調節物質含量和過氧化氫酶活性的變化情況。由此可知，滲透調節物質含量、膜脂過氧化特性、抗氧化酶活性受干旱脅迫的影響最為顯著，可將其作為燕麥萌發期應對干旱脅迫的主要生理響應指標。

表6 各綜合指標系數及貢獻率Table 6 coefficient and contribution rate of various comprehensive indicators

2.4.36份燕麥材料的耐旱性綜合評價 隸屬函數作為綜合評價作物抗逆性的方法，可有效反映供試材料的抗性強弱[27]。根據公式(1) (2)計算出各燕麥材料的3個主成分的隸屬函數值，然后根據公式(3)計算出3個主成分的權重值分別為0.594，0.265和0.141，最后根據公式(4)計算出各燕麥材料萌發期耐旱性的綜合評價值(D)，根據D值大小進行排序，耐旱性強弱依次為:‘DA92-2F4’>‘蒙燕1號’>‘加燕2號’>‘青引1號’>‘定燕2號’>‘甜燕麥’。

表7 供試燕麥萌發期各綜合指標值、權重、隸屬函數值、D值及綜合評價Table 7 The comprehensive indicator values,indiex weight,membership function value,D value and comprehensive evaluation of oat materials at germination stage

3 討論

植物在受到逆境脅迫時，會通過一系列生理代謝調節來適應脅迫環境，典型的調節方式主要有滲透調節物質的合成和抗氧化物質的變化[29]。可溶性糖可通過降低細胞滲透勢、保護細胞膜的完整、維持細胞內蛋白質的穩定而對植物起一定的保護作用[30]。本研究發現，在持續干旱脅迫72 h時，6份燕麥材料的可溶性糖含量均達到最大，且材料間差異顯著；‘DA92-2F4’和‘青引1號’的可溶性糖含量顯著高于其他材料，而‘加燕2號’和‘甜燕麥’的最低。脯氨酸作為植物中主要的滲透調節物質之一，在植物受到干旱脅迫時，它不僅降低細胞水勢，還可調節細胞質pH以防止細胞質酸化，對細胞膜的完整性有保護作用[30]。本試驗中脯氨酸含量隨脅迫時間的延長總體呈上升趨勢，但不同材料間差異也非常明顯。‘定燕2號’的脯氨酸含量隨脅迫時間的延長一直增加，96 h達到峰值；而‘DA92-2F4’在脅迫24 h即達到與‘定燕2號’96 h相似的含量，且隨后未見明顯增加；‘青引1號’在48 h達到峰值后迅速下降。尤海洋[31]在羊草(Leymuschinensis)上也得到了類似結果，隨著脅迫天數從1 d延長至5 d，羊草葉片脯氨酸含量顯著上升，且在脅迫后期也保持著較高水平。在干旱脅迫過程中，酶類抗氧化系統中的SOD會與CAT或者POD相互協作，保護膜結構從而維持細胞正常的生理功能[32]。本研究中，除‘甜燕麥’的SOD活性隨脅迫時間的延長一直上升外，其余材料的SOD，POD和CAT活性均隨脅迫時間的延長呈先升后降趨勢。在短時間干旱脅迫下，抗氧化酶系統可有效清除過量的活性氧，維持植物正常的生理活動，但長時間持續脅迫會導致抗氧化酶系統的調控能力降低，植物受損加重。趙春程等[19]在多年生黑麥草(LoliumperenneLinn.)上也得到了類似結果，用不同濃度(0，10%，15%，20%) PEG模擬干旱脅迫程度，發現在10%或15%的PEG濃度下，多年生黑麥草葉片的抗氧化酶活性最強，之后隨著脅迫程度的加劇顯著下降，抗氧化酶對活性氧的調控能力減弱。

MDA為膜脂過氧化的產物，其含量的高低是反映細胞膜脂過氧化作用強弱和質膜破壞程度的重要指標[33-34]。隨著脅迫時間的延長，燕麥MDA含量總體呈上升趨勢，但不同材料的響應明顯不同。‘DA92-2F4’在干旱脅迫24 h時MDA含量即達到峰值，隨后穩步下降，到96 h時顯著低于其他材料，說明其在脅迫前期反應較大，但很快適應了干旱環境，脅迫48 h時其脯氨酸、可溶性蛋白含量和SOD活性即達到峰值且顯著高于其他材料，表明其滲透調節能力和清除過量活性氧的能力增強，膜脂過氧化程度下降，耐旱性增強。而‘甜燕麥’的MDA含量隨脅迫時間的延長逐漸增加，到96 h時達到最大，表明在干旱脅迫過程中其細胞膜脂過氧化程度逐漸加劇，質膜受損程度加大；同時其SP，SS含量和其他材料相比隨脅迫時間的延長增幅最小，盡管SOD活性較高，但仍不足以抵御MDA含量增加帶來的損傷，因此耐旱性較弱。干旱脅迫破壞了酶保護反應和自由基生成的動態平衡，導致耐旱能力減弱[18]。

干旱脅迫下，滲透調節物質累積越多、MDA含量越低、抗氧化酶活性越強，則抗旱性越強[35-36]。本試驗中滲透調節物質、膜脂過氧化特性和抗氧化酶活性3個主成分的累計貢獻率達94.207%，可以用于反映燕麥萌發期耐旱性強弱。在整個干旱脅迫過程中，‘DA92-2F4’和‘蒙燕1號’的SS含量和CAT活性較對照分別增加了150.27%，99.68%和124.92%，52.97%；而‘甜燕麥’的SS含量、CAT活性與對照相比僅增加了32.09%和31.04%，這可能是其耐旱性較差的原因之一。裴帥帥等[37]也發現4個谷子(Setariaitalica)品種的SP，Pro含量，SOD，POD活性和MDA含量等指標在同一脅迫條件下的變化差異非常顯著，導致其耐旱性各異。不同品種的遺傳特性不同，對逆境脅迫的防御反應也不盡相同[35]，很難通過單一或個別幾個指標來評判其抗性強弱，必須綜合各類指標進行全面評價，方能得出較為可靠的結果。

4 結論

干旱脅迫對燕麥萌發期生理生化特性有顯著影響。隨著脅迫時間的延長，燕麥的抗氧化酶活性、滲透調節物質和MDA含量均顯著高于對照，其變化趨勢因供試材料不同而異；7個指標間具有較高相關性，滲透調節物質含量、膜脂過氧化特性、抗氧化酶活性可作為燕麥萌發期抗旱性綜合評價的指標；6份供試材料中，‘DA92-2F4’和‘蒙燕1號’的萌發期耐旱性較強，‘甜燕麥’耐旱性最弱。