氮添加對錫林郭勒灌叢草原羊草(Leymus chinensis)化學計量特征的影響

李 丹， 圖 雅， 史超逸， 吳倩倩， 張 曉， 時忠杰， 楊曉暉， 劉艷書*

(1. 中國林業科學研究院荒漠化研究所， 北京 100091; 2. 中國林業科學研究院生態保護與修復研究所， 北京 100091；3. 北京林業大學水土保持學院， 北京 100083)

隨著社會經濟的快速發展、化石燃料燃燒以及氮肥施用量的急劇增加導致大氣氮沉降增加，持續氮沉降在提高生產力的同時對生態系統多樣性產生威脅，改變碳、氮、磷生物地球化學循環[1]。一般認為適量氮添加可通過改變草原群落物種組成來提高草原群落生產力、恢復退化草原群落的物種多樣性[2-3]。不同植物氮利用策略不同，長期氮添加在增加灌木植物群落物種豐富度的同時會降低草本植物群落物種豐富度[4]。近期研究表明，氮添加主要是通過減少禾本科植物的方式降低半干旱區草原群落物種豐富度[5]。目前，國內關于氮沉降對灌叢草原的影響的研究非常薄弱。

近幾十年來，在氣候變化、過度放牧和土地利用方式改變等影響下，灌叢化在世界范圍內干旱、半干旱區草原生態系統中廣泛存在[6]。草原灌叢化一方面會促進草原群落凈初級生產力、養分循環及土壤有機質積累[7]，另一方面也會改變草原群落的結構和功能，降低草原群落物種豐富度、多樣性[8]。盡管目前關于灌叢化對草原群落的影響沒有統一結論，灌叢化過程會降低以牛羊放牧為主的草原群落的優質牧草生產力，限制動物的采食，影響草地生態系統多功能[9-10]。因此，過去半個世紀，美國、澳大利亞和非洲的科學家通過刈割、火燒等灌木去除手段控制草原灌叢化，但是恢復的效果是短暫的[9]。在中國也有大面積草原發生了灌叢化，其中內蒙小葉錦雞兒灌叢化草原最為典型，約占地510萬hm2，且有不斷擴張的趨勢[11-12]。目前，我國對灌叢化草原的研究剛剛起步，少量研究主要集中在灌叢化對草原群落結構的影響上[13-14]，關于氮沉降對灌叢草原植物養分含量及化學計量特征的影響尚不清晰。

化學計量是研究植物多種化學元素質量平衡的一種綜合方法，在長期進化過程中，生物體內C∶N∶P比值是相對穩定的[15-16]。Xia和Wan[17]通過對304篇文獻456種陸生植物養分含量Meta分析，發現氮添加增加了全球陸地生態系統中豆科植物地上部分N含量但對其地下部分沒有顯著影響，而非豆科雜類草和禾本科植物地上、地下組織N含量對氮添加的響應沒有明顯差異。在內蒙古典型草原的研究發現氮添加會增加植物地上部分N含量，降低C∶N[18]；羊草葉片N含量比莖高，氮添加會增加羊草莖葉N含量和N∶P，降低羊草莖葉C∶N[19]。進一步研究發現氮添加會增加典型草原植物葉片N、P含量和葉片N∶P，降低葉片C∶N和C∶P[21-22]。氮添加對典型草原米氏冰草(Agropyroncristatum)、西伯利亞羽茅(Achnatherumsibiricum)、大針茅(Stipagrandis)等草本植物葉片P含量沒有影響[23]，而Li等[24]則發現氮添加會降低禾本科植物地上部分P含量。目前的研究主要關注了氮添加對草原群落及植物個體養分狀況的影響，但是在草原灌叢化背景下，氮添加對灌叢化草原優勢種的影響并未引起足夠重視。

內蒙古錫林郭勒草原屬于歐亞大陸溫性典型草原，近年來小葉錦雞兒灌叢大面積擴張，草原群落結構和功能發生了改變。小葉錦雞兒是一種豆科固氮灌木，與草本植物相比具有較強的生存能力，其擴張可能會影響典型草原優勢植物的生長[10-11]。羊草作為典型草原主要優勢建群種，在維持草原生態系統結構與穩定性方面起著至關重要的作用[25]。因此，我們假設氮添加對灌叢下草本養分特征沒有顯著影響，但是會促進叢間草本養分積累。為驗證我們的假設，本研究以內蒙古錫林郭勒小葉錦雞兒灌叢草原優勢種羊草為研究對象，比較分析氮添加對灌叢下與灌叢間優勢物種羊草莖葉C，N，P元素含量的及其化學計量特征的影響，探討灌叢是否會削弱氮添加對典型草原優勢植物養分含量影響，以及灌叢對C∶N∶P化學計量特征的影響分異。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

本研究區位于歐亞大陸典型草原核心區，內蒙古錫林浩特市西北100 km小葉錦雞兒灌叢草原樣地(116°03′～116°07′ E，44°18′～44°25′ N)。研究區屬典型溫帶半干旱大陸性季風氣候，冬季寒冷干燥(日均溫度-22℃)，夏季溫暖濕潤(日均溫度19℃)。年降雨量為280～350 mm，降雨多集中在7—9月，占全年降水量的60%以上，無霜期90～100 d。地帶性土壤類型以暗栗鈣土為主，土層厚達1.0 m以上。地帶性植被屬溫性典型草原，植物群落以羊草為優勢種，亞優勢種有大針茅和糙隱子草(Cleistogenessquarrosa)，伴生種有胡枝子(Lespedezabicolor)、知母(Anemarrhenaasphodeloides)、狗尾草(Setariaviridis)等。灌木植物以小葉錦雞兒為主，鑲嵌分布在典型草原基質中，形成蓋度低于30%的小葉錦雞兒灌叢草原。

1.2 實驗設計及實驗處理

本研究中氮添加實驗處理采用完全隨機區組實驗設計，設置6個水平氮添加處理，分別為0 g·m-2·a-1，2.5 g·m-2·a-1，5 g·m-2·a-1，10 g·m-2·a-1，15 g·m-2·a-1和20 g·m-2·a-1(文中標記為CK，N2.5，N5，N10，N15，N20)，每個處理4個重復，共計24個小區，實驗小區面積均為50 m×20 m，相鄰小區留5 m寬的緩沖帶。在每個處理小區內選取4叢灌木，分別在灌叢下與灌叢1 m外選取草本(文中標記為灌叢下和灌叢間)，取樣時保證灌叢間草本樣品距離其他灌叢大于1 m。2018年6月開始處理氮添加實驗，為保證施肥效果，施肥時間選擇在生長季雨季來臨之前(通常在6月底大雨之前)，將預先稱好的尿素一次性均勻地施撒在樣方中，對照組不施肥。

圖1 研究區位置示意圖、實驗設計圖及灌叢化草原植被景觀Fig.1 Location of experiment site,the experimental design and the shrub encroached steppe

1.3 樣品采集與元素測定

2019年7—8月，在每個實驗小區中隨機選取4叢小葉錦雞兒，分別在灌叢間和灌叢下隨機選取20株健康、完整的羊草。將羊草齊地面剪下、裝入自封袋中，密封后放入黑暗冰箱保存，帶回實驗室后按莖、葉分開，在65℃烘箱中烘干至恒重；然后將烘干的植物樣品用球磨儀研磨，過篩后用于全碳、氮、磷測定。采用重鉻酸鉀(外加熱法)測定樣品C含量，用凱氏定氮法測定樣品全N含量，用鉬銻抗比色法測定樣品全P含量。

1.4 數據分析

本文使用SPSS Statistics 19軟件處理分析數據，采用線性混合效應模型(Linear Mixed Model)檢驗氮添加和灌叢斑塊對羊草群落養分含量與化學計量特征的影響，將灌叢作為氮添加的巢式因子。采用單因素方差分析法(One-Way ANOVA)分別檢驗氮添加對灌叢間和灌叢下羊草莖葉C，N，P含量及其化學計量的影響；采用Pearson相關分析研究灌叢間和灌叢下羊草莖葉養分含量間的相關關系；采用OriginPro 8軟件作圖。

為了分析灌叢下和灌叢間羊草莖葉C，N，P養分含量間的變異，計算了對應指標的變異系數(CV，%)。

變異系數=(標準差/算數平均值)×100%

2 結果與分析

2.1 氮添加對灌叢草原羊草莖葉C，N，P含量的影響

氮添加顯著影響羊草葉片N，P含量(P<0.05)，而對葉片C含量沒有顯著影響；灌叢斑塊對羊草葉片C，N，P含量影響顯著(P<0.05)；氮添加和灌叢斑塊的交互作用對羊草葉片C，N，P含量沒有顯著影響(表1)。氮添加使灌叢下羊草葉片N，P含量比灌叢間羊草葉片N，P含量分別顯著增加了19.3%，24.1%，而灌叢下羊草葉片C含量比灌叢間羊草葉片C含量顯著降低了4.0%。灌叢間羊草葉片N含量在19.30～22.55 g·kg-1之間，葉片P含量在0.74～0.97 g·kg-1之間，與對照組相比N10，N20處理下灌叢間羊草葉片N含量分別增加了12.4%和14.4%。灌叢下羊草葉片N含量在22.62～26.75 g·kg-1之間，葉片P含量在0.96～1.14 g·kg-1之間，其中N2.5處理下葉片P含量比對照降低了15.8%(圖2a，2b，2c)。

表1 氮添加和灌叢斑塊對羊草莖葉C，N，P含量及化學計量特征的影響Table 1 Effects of N addition,shrub patch and the interactions on the C,N,P concentration and the stoichiometric characteristics of L. chinensis

圖2 氮添加對小葉錦雞兒灌叢下和灌叢間羊草莖葉C，N，P含量的影響Fig.2 The effect of N addition rates and shrub patch on the C,N,P concentration of the leaves and stems of L. chinensis under the shrub patches and between the shrubs (mean±SE)注：不同字母表示氮素添加水平間差異顯著(P<0.05)，大寫字母表示灌叢下，小寫字母表示灌叢間。右上角小圖中***表示灌叢間及灌叢下差異極顯著(P<0.001)，**表示灌叢間及灌叢下差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)，ns表示沒有顯著差異(P>0.05)，下同Note:Different letters indicate significant differences among N addition treatments at 0.05 level,the capital and lowercase letters indicate under the shrub patches and between the shrubs,respectively;***,** and * indicate significant difference between shrub patch treatments at 0.001,0.01 and 0.05 level,respectively;ns means no significant different in the upper right figure,the same as below

氮添加顯著影響羊草莖C，N含量(P<0.05)，而對羊草莖P含量沒有顯著影響；灌叢斑塊顯著影響羊草莖N含量(P<0.05)，而對羊草莖C，P含量沒有顯著影響；氮添加和灌叢斑塊的交互作用顯著影響羊草莖N含量(P<0.05)，而對羊草莖C，P含量沒有顯著影響。灌叢間羊草莖N含量在12.45～16.22 g·kg-1，隨氮添加增加而增加，與對照相比N15和N20處理約增加了15.4%和30.2%；灌叢間羊草莖P含量在0.84～1.21 g·kg-1之間。灌叢下羊草莖N含量在12.33～14.00 g·kg-1之間，其P含量在0.93～1.11 g·kg-1之間，氮添加降低灌叢下羊草莖C含量，其中N15處理比對照降低了9.7%(圖2 d，e，f)。

2.2 氮添加對灌叢草原羊草莖葉化學計量特征的影響

氮添加及灌叢斑塊都顯著影響羊草葉片C∶N和C∶P(P<0.05)，而對羊草葉片N∶P沒有顯著影響；氮添加和灌叢斑塊的交互作用對羊草葉片N∶P，C∶N和C∶P均沒有顯著影響。隨氮添加水平的增加，灌叢間羊草葉片C∶N呈降低的趨勢，而N∶P呈增加的趨勢(圖3a，c)；灌叢間羊草葉片C∶P在N15處理下達最小值，比對照降低了9.5%(圖3b)。隨氮添加水平的增加，灌叢下羊草葉片化學計量變化趨勢均不顯著(圖3a，b，c)。

圖3 氮添加對灌叢下與灌叢間羊草莖葉C∶N，C∶P，N∶P的影響(平均值±標準誤差)Fig.3 The effect of N addition rates on the C∶N,C∶P,N∶P of the leaves and stems of L. chinensis under the shrub patches and between the shrubs (mean±SE)

氮添加對羊草莖C∶N影響顯著(P<0.05)，而對莖N∶P和C∶P沒有顯著影響；灌叢斑塊對羊草莖C∶N，C∶P和N∶P沒有顯著影響，氮添加處理和灌叢斑塊的交互作用對羊草莖C∶N，C∶P，N∶P均沒有顯著影響。灌叢間及灌叢下羊草莖C∶N隨氮添加水平的增加呈現降低趨勢，其中N10，N15和N20處理下灌叢間羊草莖C∶N比對照分別降低了16.6%，12.1%，21.2%(圖3d)。

2.3 氮添加對灌叢下與灌叢間羊草養分特征相關關系的影響

在灌叢間與灌叢下，羊草莖N含量與葉片N含量及莖葉P呈極顯著正相關(P<0.05)，莖P含量與葉片P含量呈極顯著正相關(P<0.01)，莖C含量與葉片C含量間無顯著相關性。灌叢下葉片N含量與葉片C含量呈顯著負相關(P<0.05)，與葉片P含量呈顯著正相關(P<0.05)。但是，灌叢間羊草葉片N含量與葉片C和P含量均沒有顯著相關性(圖4)。

圖4 小葉錦雞兒灌叢間(a)及灌叢下(b)羊草莖葉C，N，P含量相關分析Fig.4 Pearson correlation analysis of C,N and P concentration of the leaves and stems of L. chinensis under the shrub patches and between the shrubs注：各元素含量的單位為g·kg-1，圖中綠色表示正相關，紅色表示負相關，圓圈面積越大相關性越強；**表示極顯著相關(P<0.01)，*表示顯著相關(P<0.05)Note:In the figure,green indicates positive correlation,red indicates negative correlation,and the larger the circle area,the stronger the correlation;** and * indicate significant correlation at 0.01 and 0.05 level,respectively

2.4 氮添加對灌叢下和灌叢間羊草養分含量與化學計量特征變異系數的影響

在不同氮添加處理下，灌叢間羊草莖葉C，N，P含量變異系數和化學計量特征變異系數均高于灌叢下相應的變異系數。其中，灌叢間羊草葉片C含量的變異系數為2.95，為灌叢下羊草的2.2倍；灌叢間羊草葉N∶P的變異系數為4.94，為灌叢下羊草的1.6倍；灌叢間羊草莖C∶N和C∶P的變異系數分別達到11.28和15.11，為灌叢下羊草的1.8倍和2.2倍(表2)。

表2 不同氮添加水平下灌叢間及灌叢下羊草C，N，P含量的平均值和變異系數Table 2 Mean and coefficient of variation of the C,N,P concentration under different nitrogen addition rate for L. chinensis under the shrub patches and between the shrubs

3 討論

3.1 氮添加對小葉錦雞兒灌叢下、灌叢間羊草養分含量及其化學計量特征的影響

植物從土壤中吸收的氮元素占其總氮的45%～82%，氮添加會增加草原植物葉N含量[26-27]。本研究發現氮添加增加了灌叢間羊草莖葉N含量，降低了灌叢間羊草莖葉C∶N和葉片C∶P，而對灌叢間羊草莖葉N∶P沒有顯著影響，其中N20處理下植物莖、葉N含量比對照分別增加了30.2%和14.4%。本研究區的相關研究發現羊草葉片N含量隨著氮添加梯度的增加而增加[28]，但是氮添加對羊草葉片N∶P沒有顯著影響[29]。植物莖葉N，P元素均由根系從土壤中吸收而來，本研究所在區域屬于氮素限制的半干旱區，適量氮添加可以直接且高效的促進植物對N的吸收。同時，在一定程度上可以促進植物對P的吸收，植物N，P含量的增加使得其N∶P保持在相對穩定的狀態。C元素是植物結構物質且與N，P元素的代謝途徑不同，主要通過光合作用積累，在植物體內較為穩定，因此氮添加使得植物C∶P和C∶N降低了[30-31]。由于小葉錦雞兒為固氮植物，其庇護作用使叢下羊草生長受氮素限制較小或是不受氮素限制但是可能受到磷限制，因此氮素添加對灌叢下羊草養分特征及化學計量特征影響不顯著，但是葉片P含量可能受氮添加的影響。

目前，關于植物P元素含量及N∶P對氮添加響應的研究尚沒有統一結論。以往研究發現氮添加增加了半干旱草原區植物葉片P元素含量[32]，長期氮添加在增加溫帶草甸草原羊草葉片N∶P和C∶P的同時降低了C∶N[33]，但是De Long等[34]和Zhan等[35]則發現長期氮添加會加劇植物P脅迫，降低植物葉片P含量，增加植物N∶P。導致目前研究結果分異的原因可能是植物吸收的N，P元素均源于生存環境中的土壤溶液，適量氮添加可提高草原群落土壤磷酸酶活性，促進植物對P元素的吸收，但長期氮添加會使土壤酸化，導致植物生長環境養分失衡，限制植物對P素的吸收。另外，植物葉片P含量對氮添加的響應具有滯后效應，可能造成研究結果不一致[36-37]。

3.2 氮添加對小葉錦雞兒灌叢下、灌叢間羊草C，N，P相關關系的影響

在植物個體水平上，C，N，P的組成及分配是相互聯系的，其相互作用共同決定植物生長發育過程[36]。宋彥濤等[38]研究發現松嫩草地80種草本植物的葉片N，P呈顯著正相關。Ma等[39]發現高寒草原多年生草本莖葉間N元素，以及莖葉間P元素含量都具有顯著相關性，但植物莖葉間C沒有顯著相關性。本研究發現，灌叢間及灌叢下羊草莖與葉片之間N含量、莖與葉片之間P含量、葉片P含量和莖N含量、以及莖N和P含量間均具有顯著正相關相關性。這些結果說明氮素添加與灌叢斑塊對植物莖葉間N，P含量的關系影響較弱，短期氮素添加對灌叢草原優勢種的化學計量特征影響較小。這可能是因為植物在長期進化過程中，莖葉中N，P含量及比值已經趨于穩態，當外界養分條件發生變化時，短時間內植物會通過一系列生理調節，維持自身各器官中N，P含量相關關系，以維持在不斷變化的生長環境中穩定化學計量特征[40]。

此外，我們還發現灌叢下羊草莖葉C含量與莖葉N含量呈顯著負相關，而與莖葉P含量沒有顯著相關性；灌叢間羊草莖、葉片C含量與N，P含量均沒有顯著相關性。這表明羊草莖葉N，P元素間具有穩定的比例關系，而植物C元素與N，P元素關系相對偏弱，這可能是由于植物C同化過程與N，P養分吸收過程隸屬于不同代謝途徑所導致的[41-42]，也間接說明短期氮素添加對元素關系影響是比較弱，需要長期的研究才能發現氮添加影響的過程機理。

3.3 灌叢削弱氮添加對羊草養分含量及化學計量特征的影響

不同植物器官具有不同功能，莖部主要起支撐及輸導作用，葉片是植物進行光合和呼吸作用等重要生命活動的主要場所，對植物的生長及繁殖過程起決定性作用。本研究發現，灌叢下、灌叢間羊草葉片N含量及N∶P均比莖高。與莖相比，植物葉片具有較高的N，P含量以及N∶P穩態，本研究結果也證明了代謝活躍的器官對N，P元素的需求高[39,43]。在長期進化過程中羊草已形成了較優氮素分配策略，會優先將N元素分配給代謝旺盛的葉片組織，提高植物葉片堅韌程度和光合能力，確保葉片中各種生理代謝活動的有序運行，維持植物健康生長及種族延續。這種養分分配模式是植物在長期進化過程中形成的，不會輕易受外界環境的影響[44-46]。本研究發現灌叢下羊草葉片N，P含量比灌叢間羊草分別增加了19.3%和24.1%，但是灌叢間和灌叢下羊草莖C，N，P含量均沒有顯著差異，表明灌叢斑塊主要影響植物葉片N，P含量，對植物莖C，N，P元素含量沒有影響。灌叢下羊草葉片N，P含量均比灌叢間羊草葉片N，P含量高，可能是因為固氮植物小葉錦雞兒對其叢下草本有庇護作用，即小葉錦雞兒灌叢化過程會改善灌叢下植物的養分環境，促進草本植物N和P優先供給于活躍的葉片器官[47]。

本研究發現氮添加降低了灌叢間羊草葉片C∶P和C∶N及灌叢下羊草葉片P含量，而對灌叢下羊草莖葉N含量以及莖葉C∶N和C∶P均無顯著影響，這可能受小葉錦雞兒灌叢化影響。小葉錦雞兒灌叢化過程中，改善了灌叢下羊草的水分和養分條件，并且使氮素不再是灌叢下羊草生長的主要限制因素，但上層灌叢對光照的遮擋作用會對灌叢下羊草造成弱光脅迫，限制植物光合及呼吸作用[48-49]。灌叢下羊草為保證自身的生長發育，需要復制和轉錄大量遺傳物種核酸(P)以增加光競爭能力，這個調節過程會稀釋植物葉片中P元素的含量[40]。前人對內蒙古小葉錦雞兒灌叢化草原的研究發現灌叢斑塊田間持水量、土壤有效水量、土壤有機碳和土壤全氮均比灌叢間增加，表明小葉錦雞兒灌叢在建成過程中，會提高灌叢斑塊下土壤水養條件，并進一步影響植物葉片養分含量[50-52]。此外，我們還發現不同水平氮添加處理下，灌叢間羊草C，N，P養分含量的變異系數均高于灌叢下的，進一步證實了灌叢化會削弱氮添加對羊草養分含量及化學計量的影響[53]。

4 結論

氮添加對灌叢下和灌叢間羊草C，N，P含量及其化學計量特征的影響存在分異。氮添加顯著增加了灌叢間羊草葉片N含量，20 g·m-2·a-1處理下灌叢間羊草莖N含量，葉N含量比對照分別增加了30.2%，14.4%；氮添加顯著降低了灌叢間羊草莖葉C∶P和C∶N，10 g·m-2·a-1處理下灌叢間羊草葉片C∶N比對照降低了13.2%，15 g·m-2·a-1處理下灌叢間羊草C∶P比對照降低了9.5%。但是氮添加對灌叢下羊草莖葉N含量及莖葉化學計量特征沒有顯著影響。在氮添加與灌叢共同影響下，羊草莖葉C∶N，C∶P和N∶P均沒有變化。因此，固氮灌木小葉錦雞兒的存在降低了氮添加對叢下羊草莖葉養分含量與化學計量特征的影響，隨著固氮植物小葉錦雞兒灌叢的不斷擴張，可能會緩解氮素對草原植物的限制。灌叢化可能會削弱氮添加對草本植物的促進作用。