大孔樹脂純化苜?？傸S酮及純化前后抗氧化能力比較

李 紅， 李 波， 李晨陽， 楊 曌

(1.黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院， 黑龍江 齊齊哈爾 161005； 2.齊齊哈爾大學生命科學與農林學院， 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

黃酮類化合物分離純化的方法很多，其中大孔樹脂是近十多年飛速發展的一類有機高分子聚合物吸附劑，能夠吸附和分離大量有機物，具有污染低、穩定性高、選擇性強、易操作等優點[7]。大孔樹脂廣泛應用于中草藥活性成分的分離純化研究方面，尤其在黃酮類成分中如香椿(Toonasinensis)黃酮類成分[8]、蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)黃酮類化合物[9]和趕黃草(PenthorumchinensePursh)黃酮成分[10]等分離純化的研究。關于紫花苜蓿黃酮類化合物的純化、抗氧化活性已有相關研究[11-12]，但對紫花苜?？傸S酮的提取、純化及其抗氧化活性[13]研究鮮見報道，對苜?？傸S酮的純化和純化前后的抗氧化活性更是有待完善。

為了充分利用紫花苜蓿資源，本研究采用超聲波輔助提取的方式提取了苜?？傸S酮，大大縮短了苜?？傸S酮的提取時間，通過確定的超聲波輔助提取苜蓿總黃酮的最佳條件[14]，并且利用大孔樹脂對所獲得的總黃酮進行了純化，分析純化前后的苜?？傸S酮的抗氧化能力，為紫花苜蓿的綜合利用提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

取試驗基地種植2年的‘龍牧801’紫花苜蓿，于7月份盛花期收割其地上部分莖葉，置于避光通風處自然陰干，篩去草棒、枯草等雜質，后用高速多功能粉碎機將干草粉碎成草粉，置于密封盒內避光保存備用。

1.2 苜蓿總黃酮粗提取物的制備

前期試驗采用超聲波輔助提取苜?？傸S酮，得到最優條件為物料比1∶40(g·mL-1)、超聲功率180 W、超聲時間 40 min、乙醇體積分數 60%，提取液真空抽濾后用等體積石油醚多次萃取去除葉綠素等雜質，收集萃取后的濾液，用旋轉蒸發儀進行減壓蒸發，直至濾液無乙醇味。收集減壓蒸發完畢后的濾液，用體積分數為 60% 的乙醇重新定容至 50 mL備用，所得液體即為超聲波輔助提取法苜蓿總黃酮粗提液。

1.3 總黃酮含量測定與標準曲線的制作

1.3.1苜?？傸S酮含量的測定 采用NaNO2-Al(NO3)3顯色法[13]。移取 5.0 mL樣品液于 25.0 mL具塞刻度試管，加 5 mL 60% 的乙醇和 5% 亞硝酸鈉溶液 1.0 mL靜置 6 min，再加入 10% 硝酸鋁溶液 1.0 mL再靜止 6 min，再向其中加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液 10.0 mL靜置 15 min，后用蒸餾水定容至25 mL，同時用 60% 乙醇作空白對照，于 510 nm測定吸光值。

1.3.2標準曲線的繪制 參考荊常亮[13]方法建立標準曲線方程。用體積分數 60% 乙醇溶液配制成 0.2 mg·mL-1蘆丁標準品溶液，分別移取標準溶液(0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 和 6.0 mL) 于10.0 mL具塞試管中，用蒸餾水定容至 5.0 mL。采用1.3.1方法測定吸光值，建立標準曲線方程y =13.893x-0.005 9(R2=0.997 3)，式中x表示蘆丁質量濃度，y表示吸光值，蘆丁標準溶液在 0.00～0.48 mg·mL-1范圍內線性關系良好。

1.4 大孔樹脂預處理

參考許中暢等[15]方法。用 95%乙醇溶液震蕩浸泡 24 h(搖床設置參數為25℃，120 r·min-1，使大孔樹脂和乙醇充分接觸并去除氣泡)，采用濕法裝柱的方式將泡好的大孔樹脂裝入玻璃層析柱(Φ30 mm×300 mm)中，用 95% 乙醇淋洗樹脂柱，直至流出液澄清透明無渾濁為止。然后分別用 4 BV的4%NaOH溶液堿洗(后用去離子水淋洗過柱，當流出液pH值≤9.0 時停止水洗)和 4% HCl溶液酸洗(后用去離子水淋洗過柱，當流出液pH值≥6.0 時停止水洗)淋洗大孔樹脂，后用 95% 乙醇浸泡層析柱內樹脂 2 h，相同的乙醇過柱清洗(堿液、酸液和乙醇總用量為3～4 BV，以1 BV·h-1流速)，最后用去離子水洗至中性，在樹脂床上層保留一定液面防止干柱，備用。

1.5 大孔樹脂靜態吸附與解吸附試驗

1.5.1樹脂的篩選 分別稱取預處理好的樹脂1.0 g，加入 0.1 mg·mL-1粗提液 50 mL，25℃，120 r·min-1下震蕩吸附 24 h后過濾，測定濾液總黃酮質量濃度，即為吸附平衡液總黃酮質量濃度；收集上述飽和吸附的樹脂，用蒸餾水沖洗樹脂表面殘留的總黃酮，置于100 mL三角瓶中加入50 mL體積分數 60% 乙醇，在 25℃，120 r·min-1下解吸附 24 h后過濾，測量濾液中總黃酮質量濃度。按公式計算吸附量、吸附率、解吸量和解吸率。

式中，Q1為吸附量(mg·g-1)，E1為吸附率(%)，Q2為解吸量(mg·g-1)，E2為解吸率，C0為最初樣液總黃酮濃度(mg·mL-1)，Ce為吸附后平衡液總黃酮濃度(mg·mL-1)，V0為待純化母液體積(mL)，Cd為解吸附洗脫液中總黃酮濃度(mg·mL-1)，V2為解吸附洗脫液體積(mL)，M為濕重樹脂的質量(g)。

1.5.2靜態吸附曲線測定 選擇吸附和解吸附效果最好的大孔樹脂，稱取3.0 g置于100 mL三角瓶中，加入 0.1 mg·mL-1粗提液 50 mL，在25℃，120 r·min-1下振蕩吸附3 h，每隔0.5 h吸取5 mL，測定總黃酮含量，計算并繪制靜態吸附動力學曲線。

1.6 D101大孔樹脂純化苜?？傸S酮上樣條件的優化及驗證試驗

1.6.1吸附液pH值 稱取5份2.0 g濕重大孔樹脂置于錐形瓶中，分別加入濃度為0.1 mg·mL-1總黃酮20 mL，設置pH值為3.0，4.0，5.0，6.0和7.0，在25℃，120 r·min-1下震蕩吸附12 h后測定總黃酮質量濃度，并計算吸附率。

1.6.2上樣液質量濃度 將1.0 mg·mL-1總黃酮母液用蒸餾水配制成總黃酮質量濃度為0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg·mL-1的上樣液，根據最優pH參數調節上樣液pH值，上樣體積為2 BV，將上樣液裝入樹脂柱中后以1 BV·h-1的流速進行吸附，收集流出液，根據上樣液原始濃度和流出液濃度計算吸附率及解吸附率。

1.6.3上樣液體積 將1.0 mg·mL-1總黃酮母液用蒸餾水配制成0.8 mg·mL-1，并調成最優pH值即為待上樣液，以1 BV·h-1流速進行吸附，分別收集并測定吸附液體積達到1 BV，2 BV，3 BV和4 BV時總黃酮質量濃度，并計算吸附率。

1.6.4驗證試驗 根據上述試驗選擇最適宜苜蓿總黃酮的大孔樹脂，并按照上述篩選的吸附液pH值、上樣液質量濃度和上樣液體積最適條件進行驗證試驗，重復 3次平均值，根據吸附流出液及洗脫液OD值計算吸附率及解吸率。洗脫液用旋轉蒸發儀減壓蒸發至膏狀，置于坩堝中用電爐烤干至恒重，按公式計算大孔樹脂吸附純化后苜?？傸S酮純度。

式中，C為上樣液中總黃酮濃度(mg·mL-1)，V為上樣液體積(mL)，M1為烘干后干粉質量(mg)。

1.7 粗制和純化的苜?？傸S酮抗氧化活性測定

1.8 數據的處理與分析

試驗數據用SPSS 19.0和Excel軟件進行統計分析，采用單因素方差分(Anova)比較不同處理間的差異顯著性，P<0.05時有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 4種大孔樹脂吸附及解吸附效果對比

大孔樹脂的孔徑和比表面積影響其對活性成分的“吸附-解吸”性能，二者呈負相關。4種大孔樹脂對苜?？傸S酮的吸附和解吸附效果見表1，在相同條件下，這4種大孔樹脂對苜?？傸S酮都有一定的“吸附-解吸”能力，其靜態吸附率排序為AB-8>D101>HPD100>HPD600，D101和AB-8與HPD100，HDP600之間存在顯著差異(P<0.05)；其靜態解吸率排序為D101>AB-8>HPD100>HPD600，D101，AB-8與HPD100和HDP600之間存在顯著差異(P<0.05)，這可能是因為AB-8和D101大孔樹脂結構與理化性質決定的，利于苜?？傸S酮的吸附和洗脫，綜合考慮吸附率和解吸率，D101大孔樹脂是純化苜?？傸S酮較為理想的樹脂。

表1 4種大孔樹脂吸附及解吸附效果對比Table 1 Comparison of adsorption and desorption effects of four macroporous resins

2.2 D101大孔樹脂靜態吸附曲線

D101大孔樹脂對苜蓿總黃酮的靜態吸附量和提取液總黃酮含量變化見圖1。在吸附前2 h，苜?？傸S酮的吸附量隨著時間增加而上升，2 h后上升速率降低，吸附量趨于平緩，吸附2 h平均吸附量為0.72 mg·g-1，比第3小時降低0.03 mg·g-1，再增加吸附時間其吸附量變化不顯著，說明D101大孔樹脂對苜?？傸S酮吸附性能較好，吸附2 h左右基本達到吸附飽和值。D101大孔樹脂對苜蓿總黃酮的吸附為快速平衡型，初始總黃酮質量濃度為0.1 mg·mL-1，2 h后基本達到平衡，對苜?？傸S酮具有良好的吸附動力學特性，該樹脂對苜?？傸S酮有良好的吸附特性，適于分離純化苜?？傸S酮。

圖1 D101大孔樹脂靜態吸附曲線Fig.1 Static adsorption curve of D101 macroporous resin

2.3 動態試驗條件的確定

2.3.1上樣液pH值的確定 由圖2A可知，D101大孔樹脂對苜?？傸S酮的吸附率隨上樣液pH值增加而減小，這是因為苜?？傸S酮含有多羥基酚類而表現為弱酸性，當pH值為3.0時吸附率最高為69.63%，而堿性環境時俘獲的質子會使總黃酮自由基上的氫解離為酸根離子，減弱與樹脂的結合力，導致對總黃酮吸附率下降，在pH值為7.0時吸附率最低為32.30%，不同pH值的上樣液對苜蓿總黃酮的吸附率產生顯著差異(P< 0.05)。因此本試驗中當pH值為3.0時D101大孔樹脂對苜蓿總黃酮吸附效果最佳。

2.3.2上樣液質量濃度的確定 由圖2B可知，隨著上樣液質量濃度的增加，大孔樹脂對苜?？傸S酮的吸附率呈先升后降的趨勢，在總黃酮質量濃度為0.8 mg·mL-1上柱時，吸附率最大為92.27%，超過此質量濃度后吸附效果下降,因為上樣液質量濃度偏高,會發生提早泄漏現象,導致處理量下降；總黃酮質量濃度為0.2 mg·mL-1上柱時，吸附率最低，上樣液質量濃度偏低，吸附不充分,降低了吸附率，上樣液質量濃度為0.4和0.6 mg·mL-1與其它濃度間比較苜?？傸S酮的吸附率差異顯著(P<0.05)。

2.3.3上樣液體積的確定 由圖2C可知，在上樣液體積為1 BV，2 BV，3 BV和4 BV時，隨著上樣液體積增加吸附率呈下降的變化趨勢，當上樣體積為2 BV時吸附率最大為93.62%，超過2 BV后吸附率劇烈下降，可能是上樣體積在2～3 BV之間時發生了泄漏，影響吸附效果，當上樣體積為2 BV時D101大孔樹脂吸附效果比較好，上樣液體積為1和2 BV時苜蓿總黃酮的吸附率顯著高于上樣體積為3和4 BV(P< 0.05)。

圖2 上樣液條件對苜?？傸S酮吸附率的影響Fig.2 Effect of sample loading conditions on adsorption rate of total flavonoids from alfalfa

2.4 苜蓿總黃酮純化工藝驗證

以D101大孔樹脂對苜蓿總黃酮進行純化，在確定的上樣液pH值為3，上樣液質量濃度為0.8 mg·mL-1，上樣體積為2 BV的純化參數條件下，經過3次重復試驗，對純化條件進行驗證(表2)。流出液吸附率平均值為92.72%，洗脫液解析率平均值為75.99%，較控制單一因素的純化效果為好。

表2 純化工藝驗證Table 2 Validation test data

洗脫液干燥至粉末狀后稱重，3組重復試驗的苜?？傸S酮純度平均值為31.46%，可有效去除了其中雜質，因此D101大孔樹脂對苜?？傸S酮的純化工藝可行，但該結果所得純度比較低，可進一步采用聚氨酰樹脂純化以提高苜蓿總黃酮粗提液的純度。

2.5 苜?？傸S酮純化前后抗氧化能力比較

2.5.1清除DPPH·能力 由圖3A可知，苜蓿總黃酮粗提物與純化物都具有較強的清除DPPH·能力，隨苜?？傸S酮質量濃度的增加而增大。當粗提物、純化物和VC的濃度為0.2 mg·mL-1時，對DPPH·的清除率分別為81.53%，88.54%和93.23%，粗提物、純化物和VC的濃度為1.0 mg·mL-1時，較濃度為0.2 mg·mL-1對DPPH·的清除率分別增加了12.46%，5.60%和2.94%。相同質量濃度下純化物均促進了對DPPH·的清除能力，但對DPPH·的清除率均低于VC，純化物總黃酮質量濃度1.0 mg·mL-1較相同濃度下的VC對DPPH·的清除率減少了2.58%,差異不顯著。

2.5.2清除ABTS+·能力 由圖3B可知，苜?？傸S酮粗提物與純化物都具有較強的清除ABTS+·能力，隨苜?？傸S酮質量濃度的增加而增大。當粗提物、純化物和VC的濃度為0.2 mg·mL-1時，對ABTS+·的清除率分別為74.63%，81.74%和95.29%，粗提物、純化物和VC的濃度為1.0 mg·mL-1時，較濃度為0.2 mg·mL-1對ABTS+·的清除率分別增加了14.08%，13.11%和0.63%。相同濃度下純化物均促進了對ABTS+·的清除能力，但對ABTS+·的清除率均低于VC，純化后總黃酮質量濃度1.0 mg·mL-1較相同濃度下的VC對ABTS+·的清除率減少了1.93%，差異不顯著。

圖3 純化前后總黃酮和Vc對自由基清除能力Fig.3 Free radical scavenging ability of total flavonoids before and after purification and Vc

2.5.3清除·OH能力 由圖3C可知，苜?？傸S酮粗提物與純化物都具有較強的清除·OH基能力，隨苜?？傸S酮質量濃度的增加而增大。當粗提物、純化物和VC的濃度為0.2 mg·mL-1時，對·OH的清除率分別為26.18%，66.52%和77.94%，粗提物、純化物和和VC的濃度為1.0 mg·mL-1時，較濃度為0.2 mg·mL-1對·OH的清除率分別增加了241.60%，40.57%和11.70%。在純化前后總黃酮質量濃度低于0.6 mg·mL-1時，其對·OH的清除率低于VC，但當總黃酮質量濃度為0.8 和1.0 mg·mL-1時，純化后的總黃酮對·OH的清除率高于VC，分別增加了3.52%和6.90%。

3 討論

3.1 大孔樹脂對苜?？傸S酮純化效果的影響

大孔樹脂在植物生物活性成分分離純化研究中具有良好的吸附性和反復利用等特點，通過物理作用將黃酮類物質吸附在自身孔隙中，從而達到有效分離純化的目的[16]。前人在純化苜?？傸S酮的研究中，選擇了具有不同性質的大孔樹脂，陳佩佩和荊常亮認為苜?？傸S酮的純化中，AB-8和D101大孔樹脂有較好的吸附和解吸附效果，對苜?？傸S酮的純化效果比較好，與本研究在大孔樹脂篩選的結果基本一致；本研究篩選的苜蓿總黃酮上樣液質量濃度為0.8 mg·mL-1，與他們在上樣液質量濃度為0.528 mg·mL-1和0.6 mg·mL-1有較大的差異；上樣體積選擇上，不同的學者研究結果差異比較大，荊常亮選擇了4 BV和陳佩佩選擇了3 BV，而本研究篩選的結果為2 BV，試驗發現過高的上樣體積影響了吸附的效果，流速越慢越利于樹脂吸附苜?？傸S酮；在上樣液pH值選擇上，與前人的研究所選pH值多為3～4結果一致，說明紫花苜?？傸S酮這種弱酸性物質在酸性環境中有很好的吸附效果[17]。本研究在確定上樣液質量濃度為0.8 mg·mL-1，上樣體積為2 BV，上樣液pH值為3的純化參數條件下，苜蓿總黃酮純度可達到 31.46%，與荊常亮用AB-8大孔吸附樹脂富集紫花苜?？傸S酮后純度可達33.03% 結果相近，與陳佩佩純化獲得純化率48.52%差異比較大，苜蓿總黃酮的分離純化過程中受各種因素的影響，導致人們在純化苜?？傸S酮時產生較大的差異。

3.2 苜?？傸S酮對自由基清除能力的影響

4 結論