醋制工藝對孜然化學成分的影響及整體特征分析*

李晨陽，衡天瑜，蘇文靈，徐芳，張麗，2

(1.新疆維吾爾自治區藥物研究所維吾爾藥重點實驗室，烏魯木齊 830004；2.北京協和醫學院&中國醫學科學院藥物研究所晶型藥物研究北京市重點實驗室，北京 100050)

孜然(CuminumcyminumL.)是傘形科植物孜然芹的干燥成熟果實。孜然呈黃褐色、扁平弧形，有較為強烈的芳香氣味[1]。孜然在新疆的種植歷史悠久，可追溯到一千年前，且全國90%以上的孜然產自新疆[2]。孜然是一種重要的民族藥材，《普濟方》中記載孜然可用于治療消化不良和胃寒、腹痛等。據《唐本草》記載，將孜然炒熟后研磨成粉，就著醋服下去，還有治療心絞痛和失眠的作用?，F代藥理學研究主要以孜然揮發油的活性為主，如抗炎、殺菌、抗氧化和抗腫瘤作用等[3-4]。枯茗醛(Cuminaldehyde)是孜然的標識性成分和有效成分，占孜然揮發油總量的45%～63%。

基于傳統中醫藥分支的維吾爾醫藥，在臨床中應用孜然多是經過炮制處理，炮制品有醋制孜然、鹽炒孜然和炒孜然，其中醋制孜然最為常用[5-7]。根據《新疆維吾爾自治區中藥維吾爾藥飲片炮制規范》[8]，醋制孜然的炮制方法為：取凈孜然，加4倍量的葡萄醋浸泡1晝夜，撈出晾干，然后炒干至黃備用。但該炮制方法部分參數(如炒制溫度、炒制時間等)不明確，可能影響醋制孜然炮制品的質量，亟需考察研究?？蒈╇m是孜然中的主要標識性成分，但筆者未見孜然藥材中有關枯茗醛的含量測定文獻[9-12]。因此，本研究對醋制孜然的炮制工藝參數進行了考察，首次采用高效液相色譜法對孜然中枯茗醛含量進行測定。另外，傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法和粉末X射線衍射分析法具有快速、簡便、圖譜穩定、指紋性強，已成為成分分析的重要手段[13-15]，X射線熒光光譜分析樣品前處理簡單，具有檢測元素多、分析速度快、精度高、重復性好、成本低和無損檢測等突出優勢[16]，故筆者采用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法和粉末X射線衍射法對各孜然樣品進行整體特征分析，采用X射線熒光分析法對各孜然樣品進行整體元素含量比較，以便深入研究醋制工藝對孜然飲片成分含量、整體特征和元素含量的影響。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(配備DAD檢測器，美國安捷倫公司)；AL-204型電子天平(梅特勒-托利多上海有限公司，感量：1 mg)；XS-105 型分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器公司，感量：0.1 mg)；Spectrum400型傅里葉紅外光譜儀(英國PerkinElmer公司)；D/max-2550 型粉末X射線衍射儀(日本Rigaku公司)；ZSX Primus Ⅱ X射線熒光光譜儀(日本Rigaku公司)。

1.2試藥 枯茗醛對照品購自美國ChromaDex公司(批號：00003918-568，化學純度：98.2%)；木犀草素對照品購自中國食品藥品檢定研究院(批號：111520-200504)；孜然藥材購自新疆仁譽中藥飲片有限公司(經新疆維吾爾自治區藥物研究所何江研究員鑒定)；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1醋制孜然樣品制備 根據《新疆維吾爾自治區中藥維吾爾藥飲片炮制規范》醋制孜然的炮制方法，制備不同炮制條件的樣品：醋孜然(取凈孜然加4倍量葡萄醋浸泡1晝夜，撈出晾干)，不同炒制溫度樣品(80，100，140 ℃，樣品顏色及狀態分別為黃色質脆、焦黃質脆、黃黑質脆)，不同炒制時間樣品(80 ℃炒制17，23，29 min，樣品顏色及狀態分別為黃色質地稍軟、黃色質脆、焦黃質脆，分別標記為80-1，80-2，80-3)，生孜然(孜然原藥材凈制)。

2.2枯茗醛含量測定[17-19]

2.2.1色譜條件及系統適用性實驗 色譜柱為Agilent Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.08%磷酸溶液(58：42，V/V)，流速為1 mLmin-1，檢測波長為257 nm，進樣量為10 μL?？蒈├碚摪鍞?8 330，說明在選定的條件下，色譜柱的某些條件如柱長、載體性能及色譜柱填充均符合要求，測定效果良好?？蒈┓蛛x度R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)=3.19，根據《中華人民共和國藥典》(2020版)規定“分離度應大于1.5”，分離度符合要求。在上述色譜條件下，孜然中枯茗醛的色譜峰與其他成分分離度良好。見圖1所示。

1.枯茗醛。圖1 陰性品(A)、對照品(B)與孜然樣品(C)HPLC色譜圖1.Cuminaldehyde.Fig.1 HPLC chromatograms of negative sample(A), reference substance of cuminaldehyde(B)and sample of Cuminum cyminum L.(C)

2.2.2溶液的制備 ①枯茗醛對照品溶液制備：取枯茗醛適量，精密稱定，加無水乙醇制成每毫升含0.884 mg的溶液。②供試品溶液制備：取孜然樣品粉末[過四號篩，篩孔內徑(250±9.9) μm]0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入無水乙醇50 mL，稱定質量，超聲提取10 min，放冷至室溫后用無水乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3線性關系考察 精密量取枯茗醛對照品溶液0.1，0.2，0.5，1，2 mL，置不同10 mL量瓶中，另取0.1 mL置于25 mL量瓶，分別加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取各對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結果枯茗醛標準曲線方程為：Y=63 823X+21.85，r=0.999 9，表明枯茗醛在0.0035～0.173 6 mg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.2.4精密度實驗 取同一份供試品溶液連續進樣6次測定?？蒈┓迕娣e的RSD為0.48%，結果表明儀器精密度良好。

2.2.5重復性實驗 準確稱取同一樣品，按“2.2.2”項制備6份供試品溶液，并按上述色譜條件測定?？蒈┖繛?.75%，RSD為1.58%，表明本方法重復性良好。

2.2.6穩定性實驗 取同一供試品溶液，分別在0，1，3，5，7和20 h進樣測定?？蒈┖康腞SD為0.86%，結果表明供試品溶液在20 h內穩定。

2.2.7加樣回收率測定 取已知含量的樣品粉末6份，每份約0.05 g，精密稱定，分別加入0.868 1 mg·mL-1的枯茗醛對照品溶液0.41 mL，再加入無水乙醇至刻度，按“2.2.2”項下供試品溶液制備項下進行操作。枯茗醛平均回收率為97.61%，RSD為1.11%，結果見表1。

表1 枯茗醛加樣回收率測定結果 Tab.1 Recovery test results for cuminaldehyde n=6

2.2.8各樣品含量測定 取孜然各樣品粉末約0.1 g，精密稱定，按“2.2.2”項下供試品溶液制備進行操作。

2.3木犀草素含量測定 按照《新疆維吾爾自治區藥品監督管理局藥材標準—孜然(2020YC-0010)》項下方法進行各樣品中木犀草素含量測定。

2.3.1色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液(50：50，V/V)，流速為1 mL·min-1，檢測波長為350 nm，進樣量為10 μL。

2.3.2對照品溶液制備 取木犀草素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含5.472 μg的溶液。

2.3.3供試品溶液制備 取孜然樣品粉末[過四號篩，篩孔內徑(250±9.9) μm]約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質量，超聲提取0.5 h，放冷至室溫后用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3.4各樣品含量測定 取孜然各樣品粉末約1 g，精密稱定，按“2.3.3”項下供試品溶液制備進行操作。各樣品含量測定結果見表2。

2.4揮發油含量測定 照揮發油測定法(《中華人民共和國藥典》2020年版第四部通則2204)測定。各樣品含量測定結果見表2。

表2 孜然樣品枯茗醛、木犀草素、揮發油測定結果 Tab.2 Content determination results of cuminaldehyde, luteolin and volatile oil in Cuminum cyminum L.sample

2.5傅里葉變換衰減全反射紅外光譜特征分析

2.5.1樣品制備與實驗條件 ①樣品制備：將7個不同孜然樣品研磨粉碎并過篩孔內徑0.150 mm(100目)篩，備用。②傅里葉變換衰減全反射紅外分析實驗條件：采用衰減全反射方式(ATR)，光譜掃描范圍650～4000 cm-1，分辨率4000 cm-1，掃描次數16次，測力計值80。③粉末X射線衍射分析實驗條件：銅靶Kα輻射，石墨單色器，管壓40 kV，管流150 mA，掃描速度8°·min-1，步長0.02°，發散狹縫DS=1°，接收狹縫RS=0.15 mm，散射狹縫SS=1°，2θ在3°～80°范圍內記錄樣品的PXRD圖譜。

2.5.2供試品制備方法 精密稱取孜然樣品各100 mg，分別采用紅外光譜法進行傅里葉變換衰減全反射紅外光譜分析。

傅里葉變換衰減全反射紅外光譜結果見圖2所示。研究結果表明，7個樣品的紅外光譜中不存在明顯差異，原因主要是紅外光譜是基于有機分子中振動能級和轉動能級的躍遷，反映了有機化合物分子中化學鍵或官能團的信息。證明了孜然樣品在炮制前后有機化合物成分在紅外光譜中變化并不明顯。

圖2 7個孜然樣品的傅里葉變換衰減全反射紅外光譜Fig.2 Fourier transform attenuated total reflection infrared spectrometry of seven Cuminum cyminum L.samples

2.6粉末X射線衍射圖譜特征分析 供試品制備方法：采用粉末X射線衍射法對7個孜然樣品進行分析。實驗結果見圖3所示。結果表明，7個樣品的粉末X射線衍射峰位置和強度存在以下差異：①生孜然和其他6個樣品比，在2θ值為28.12°、30.94°、40.44°處有三個強度較高的衍射峰，而缺少32°、35°、38°位置的衍射峰；②生孜然和醋孜然在20°最強衍射峰處沒有肩峰出現，炒制后的孜然樣品在最強衍射峰處都有肩峰出現；③炒制后的孜然樣品衍射峰比生孜然趨于平緩，表明炒制后的孜然樣品中無機鹽等晶態成分趨于減少；④孜然80 -3和孜然140 均為炒焦樣品，二者在45°后衍射峰強度進一步降低，且衍射峰數目較少。

圖3 7個孜然樣品的粉末X射線衍射圖譜Fig.3 Powder X-ray diffraction patterns of seven Cuminum cyminum L.samples

2.7X射線熒光光譜特征分析 ①樣品制備與實驗條件：同“2.5.1”項；②供試品的制備方法：精密稱取孜然樣品各約400 mg，分別采用X射線熒光光譜儀進行分析，每個樣品平行測定3次。③X射線熒光光譜分析實驗條件X射線熒光光譜儀分析條件：分析線Kα，衰減器1/1，探測器PC，含量前210位的特征元素分析實驗條件見表3所列。結果見圖4所示。研究結果表明，7種樣品含量最高的元素是C、O、N、K、Ca、Cl，其次是Mg、P、S、Na。7種樣品都含有Fe、Zn、Br。生孜然中不含Ni，其余炮制樣品中雖然顯示出微量Ni成分，但是含量均低于0.01%，并不會對孜然功效產生明顯影響，微量Ni元素主要是由于炮制過程引入的，有待進一步考察。孜然經醋制后，K、Ca、Cl、Mg、S、Na含量均下降。

圖4 7個孜然樣品的X射線熒光元素分析圖Fig.4 X-ray fluorescence elemental analysis diagrams of seven Cuminum cyminum L.samples

表3 X射線熒光光譜分析實驗條件值 Tab.3 Experimental condition value of X-ray fluorescence spectrometry

3 討論

對藥材進行加工炮制使毒性降低或消失、緩和藥性、增強療效，同時有利于藥材有效成分的充分溶出。炮制工藝包含著深厚的中醫藥理論的獨到之處與豐富的臨床經驗，是中醫藥的特色，也是具有民族特色的獨特制藥技術。由于歷史條件和科學技術的限制，炮制工藝的具體參數、質量標準、輔料的制備等都缺乏統一的加工炮制標準，應在繼承傳統炮制技術和理論的基礎上，利用現代科學技術使其應用科學化、規范化，以期生產出優質的中藥飲片，為實現全民大健康提供安全有效的中藥飲片。基于此，本研究對維吾爾藥醋制孜然的炮制工藝參數和質量特性進行了考察，以期為其質量控制提供依據。

在《新疆維吾爾自治區藥品監督管理局藥材標準-孜然(2020YC-0010)》中，孜然藥材的質量標準除常規的性狀，粉末鑒別，薄層色譜鑒別，檢查(雜質、水分、總灰分、酸不溶性灰分)，浸出物外，在含量測定項下測定了揮發油含量和木犀草素含量，其中揮發油含量限度為不得少于3.0%(mL/100 g)，木犀草素含量限度為不得少于0.015%。由于木犀草素是一種天然黃酮類化合物，在自然界中分布廣泛，可從多種天然藥材、蔬菜果實中分離得到，將其用于孜然藥材的質量控制，專屬性稍差，而且其在孜然中的含量也不高，藥材標準中其含量限度僅為1.5/105。文獻報道，枯茗醛是孜然的標識性成分和有效成分，占孜然揮發油總量的45%～63%，然而孜然藥材標準中并未將枯茗醛的含量測定納入其中，可能與國內暫無枯茗醛對照品有關。本研究在孜然藥材標準的基礎上，于醋制孜然炮制工藝研究中新增了枯茗醛含量作為考察指標(采用美國ChromaDex公司的枯茗醛對照品，化學純度98.2%)，以期為進一步提升孜然質量控制手段提供依據。同時，由于粉末X射線衍射分析和X射線熒光分析等方法具有一定專屬性和新穎性，而且是藥材全成分分析，將它們用于醋制孜然的炮制工藝研究也是一種嘗試和探索，以期為中藥材炮制提供有益參考。

孜然具醒腦通脈、降火平肝等功效，能祛寒除濕、理氣開胃，對消化不良、開胃下氣、消食化積均有療效[1-2]；葡萄醋以近成熟的生葡萄釀制而成，具有散瘀消積、解毒等作用，經葡萄醋浸泡過的孜然炒制后會調整其過度干熱之性，降低其含油量，消除對消化系統的刺激作用，增強其驅風散寒、通經、消腫、利尿等療效[20]。本研究中孜然經葡萄醋浸泡24 h撈出晾干后，孜然顏色變淺，氣味中帶著酸味，而浸泡過孜然的葡萄醋則由清亮的淡黃色變成棕褐色。在孜然的炒制過程中，孜然的辛辣味不斷溢出，并伴有爆鳴聲，此現象與枯茗醛和揮發油含量測定結果相一致，說明隨著炒制時間延長和炒制溫度升高，會造成枯茗醛含量和揮發油含量逐漸降低。但炒制時間和炒制溫度對非揮發性成分木犀草素含量無明顯影響。粉末X射線衍射法結果表明，醋浸泡和炒制工藝使孜然的整體化學成分發生了改變，為其后續研究提供了新的譜學分析依據。X射線熒光分析法結果表明，醋制后孜然中的金屬元素含量明顯降低。以上實驗結果表明醋制后各成分的變化可能是導致其功能主治發生改變的原因。在維吾爾醫臨床應用中，孜然的炮制品除了醋制孜然，還有鹽炒孜然和炒孜然，本文只對醋制孜然工藝進行了研究，后續筆者將對鹽炒孜然和炒孜然的炮制工藝進行進一步研究。