熱敏灸對IBS模型大鼠血清及結腸組織中SP、CGRP表達的影響＊

章海鳳，李小清，李琳慧，周志剛，周 旭，龔 安，顏純釧，龔紅斌，曾 婷，付 勇＊＊

（1.江西中醫藥大學附屬醫院 南昌 330006；2.江西中醫藥大學針灸推拿學院 南昌 330004）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome ，IBS）是一種較為常見的功能性胃腸疾病，臨床上患者主要表現為腹部疼痛及排便習慣的改變[1]。目前西醫治療多采用解痙類藥物、導瀉劑、止瀉劑、益生菌類藥物、抗抑郁類藥物等以針對患者不同癥狀進行治療，然而因藥物治療不能全部根治、易出現便秘、頭痛、惡心、神經過敏等藥物毒副作用以及患者可能呈現依賴性等原因導致患者的服藥依從性、自主性欠佳，整體治療效果未達理想效果，故嚴重影響此類患者的正常生活、工作及生存質量。此外，因其發病機制復雜、病情反復難以治愈，對于患者的就醫成本及社會的醫療成本均造成一定壓力。故完善此疾病的生理病理基礎、疾病產生機制，找尋有效的治療手段對于IBS患者及現代醫學來說有重要意義。

現如今雖有眾多學者聚焦于IBS的相關研究，但仍對其發病機制未有清晰、完整的闡述。其中研究表明IBS與內臟高敏感性、胃腸動力紊亂有緊密聯系[2]。近年來隨著現代醫學研究的深入，眾多研究結果表明IBS患者大腦（中樞神經）與胃腸道（腸神經系統）兩者之間存在異常互動。在腦-腸相互作用過程中，腦腸肽的表達異常起著重要作用，其表達水平可直接影響內臟超敏反應的程度。SP、CGRP均屬于腦腸肽，兩者可共同存在、相互作用以參與傷害性疼痛信息的傳送，從而IBS患者出現腹痛、腹瀉等癥狀[3]。

熱敏灸作為中醫療法中的一種安全、有效的治療手段，對于IBS的治療頗有優勢。事實上，近年來有多項臨床研究表明熱敏灸可有效治療IBS且相較傳統艾灸效果更甚[4-6]。但目前針對熱敏灸有效治療IBS的機制研究尚未全面，且未發現從SP、CGRP因子方向探索熱敏灸發揮治療IBS作用的研究?；诖?，本次實驗通過本研究通建立IBS大鼠模型，觀察熱敏灸干預后大鼠血清及組織中SP、CGRP的蛋白表達水平變化，研究其可能機制，以期為其臨床使用提供部分實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組情況

30只SD大鼠（雄性，6-8周，190±10 g），SPF級，購自湖南斯萊克景達生物有限公司，按組別分籠飼養，動物房飼養環境滿足自由進食、自由進水、溫度20℃-25℃、濕度50%-70%、環境安靜、晝夜交替（光照周期12 h/12 h）。許可證號：SCXK（湘）2011-0003。本次實驗全程于江西中醫藥大學實驗動物中心進行，已通過江西中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批（審批號：JZLLSC20220491）。

1.2 實驗藥物與試劑

熱敏灸艾條（江西中醫藥大學附屬醫院，6 mm×120 mm，二級精艾絨）；SP（Substance P）ELISA Kit（Elabscience、E-EL-0067c、96T）；Rat CGRP1（Calcitonin Gene Related Peptide 1）ELISA Ki（tElabscience、E-ELR0135c、96T）；包埋石蠟（69019361，國藥集團），無水乙醇（10009218，國藥集團），二甲苯（10023418，國藥集團），兔多抗 SP（DF7522，affinity）；兔多抗 CGRP（DF7386，affinity），中性樹膠（10004160，國藥集團）。

1.3 實驗儀器

紅外電子體溫計（華盛昌（CEM））；高速低溫離心機（上海安亭科學儀器廠TGL-16-aR）；切片機（RM2145、德國 Leica公司）、攤片機（HI1210、德國Leica公司）、烤片機（HI1220、德國Leica公司）；GNP-9080隔水式恒溫孵育箱（上海精宏實驗設備有限公司）；CX31生物顯微鏡（日本Olympus公司）；酶標儀（Thermo）。自制束縛瓶，自制艾灸器等。

1.4 造模方法

采用番瀉葉煎汁灌胃結合慢性不可預見性刺激建立IBS-D模型[7]，造模周期共21天。制備番瀉葉藥液及灌胃方法如下：按照所需造模的大鼠體質量計算對應番瀉葉藥液量、番瀉葉生藥量，紗布包裹番瀉葉并將其置于4倍藥量體積的沸水中浸泡0.5 h，過濾殘余藥渣后煎煮藥液至生藥濃度為0.45 g·mL-1葉藥液，4℃冰箱保存。大鼠灌胃量根據其體質量按10 mL·kg-1標準進行，1次/日。慢性不可預見性刺激共5中刺激因子，含24 h禁水、24 h禁食、晝夜顛倒、4℃冰水游泳3 min、束縛制動2 h，造模期間每日隨機安排1種刺激因子，每種至少出現3次，注意同種刺激因子不能連續出現，以免動物預料刺激發生。

1.5 干預方法

空白組不予任何刺激，正常條件下飼養；造模組大鼠隨機分為模型組（6只）及艾灸組（18只）。模型組于造模成功后不予任何刺激，艾灸組采用熱敏灸艾條艾灸“命門”穴，每天每次40 min，共14天。期間觀察大鼠尾溫變化，其中尾溫波動＞1℃為熱敏灸組，尾溫波動≤1℃為非熱敏灸組，尾溫于1℃反復波動的大鼠不納入此次實驗觀察。最后熱敏灸組、非熱敏灸組各納入6只符合要求大鼠

1.6 樣本采集

實驗期間，觀察大鼠一般狀況如精神狀態、體質量、糞便等。實驗結束后禁食24 h，選用濃度為1%戊巴比妥鈉、通過腹腔注射的方式麻醉大鼠（當天稱取大鼠體質量并記錄，按45 mg·kg-1比例行腹腔注射），待大鼠進入深度麻醉狀態后后行腹主動脈取血法采集大鼠血液，每只3 mL左右。低溫離心后標記好組別置于-80℃冰箱中保存，同時快速剪取大鼠結腸組織固定于4%多聚甲醛溶液內保存。

1.7 檢測方法

1.7.1 一般情況及造模情況

實驗期間內注意觀察各組大鼠一般狀況，如精神狀況、毛發、糞便、自由活動情況等，觀察造模情況。

1.7.2 ELISA檢測大鼠血清中SP、CGRP表達

取1份血清標本，于冰上融化后低溫離心取其上清液。室溫下打開ELISA試劑盒，嚴格按照說明書上步驟進行操作。

1.7.3 免疫組化法檢測大鼠結腸組織中SP、CGRP表達

將結腸組織進行脫水、包埋后切片，切片常規脫蠟、修復抗原后封閉30 min，PBS清洗3次后滴加相應抗體，最后進行染色處理；顯微鏡下觀察各組大鼠結腸組織不同染色反應，其中正常組織呈現藍紫色，陽性反應呈現為不同程度的棕黃色或棕褐色。鏡下不同倍數隨機采集3個視野，測定其光密度（OD）值。光密度積分（IOD）=陽性面積×OD/總面積，IOD平均值即為其陽性表達量。

1.8 統計學分析

采用SPSS 22.0統計所得數據；計量資料以均數±標準差（）表示。統計在滿足正態檢驗的前提下，采用單因素方差分析比較多組數據，采用LSD-t檢驗比較兩兩組間數據，以P＜0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況及造模情況

在正常條件下飼養期間，所有大鼠精神活躍，精力旺盛，毛發光澤不易掉，糞便軟硬適中，多呈橢圓形；造模期間大鼠精神活躍度降低，自主活動明顯減少，毛發枯槁易抓落，糞便時干時??；經干預后，相比模型組，艾灸組情況有所改善，其中熱敏灸組大鼠情況好轉更為明顯。

模型組大鼠除了精神、自主活動、糞便性質的改變外，病理形態學結果提示，相比空白組，該組的組織結構出現一定程度的紊亂，呈現輕度的炎性細胞浸潤狀態，但無水腫、增生等情況，符合IBS病理形態學變化（見圖1）。

圖1 結腸黏膜造模前后組織形態

2.2 大鼠血清中SP、CGRP表達

與空白組相比，模型組及其他治療組中SP、CGRP的表達水平明顯增高（P＜0.01）；經干預后，與模型組相比，熱敏灸組、非熱敏灸組中SP、CGRP蛋白表達降低，其中熱敏灸組降低最為明顯（P＜0.01）（見表1，圖2）。

2.3 大鼠結腸組織中SP、CGRP表達

與空白組相比，其他各組中SP、CGRP的表達水平明顯增高（P＜0.01）；經干預后，與模型組相比，熱敏灸組、非熱敏灸組中SP、CGRP蛋白表達降低，其中熱敏灸組降低幅度最明顯（P＜0.01）（見表2，圖3，圖4）。

3 討論

IBS在傳統中醫學中可歸屬于“泄瀉”、“腹痛”等范疇，臨床癥狀主要以腹痛、腹瀉、腹脹等腹部不適為主，或伴有排便習慣的改變。現西醫治療多使用鎮靜、解痙、止瀉等藥物治療改善患者癥狀，然此種單一藥物治療效果一般，未達患者理想療效。因此尋找有效、便捷、安全的治療IBS的方式是臨床醫學亟需解決的問題及難點。中醫在此類疾病治療上具有頗多經驗，療法多元，療效顯著。針灸作為中醫外治法中的一種特色治療手段，在IBS的治療中有著特別優勢。有研究證明針灸的治療效果優于西藥，且癥狀改善程度更高、復發率更低[8]。熱敏灸作為一種有效、安全的新型艾灸療法，可通過艾灸敏化腧穴、最大程度激發人體經氣感傳以達到氣至而有效。有臨床研究表明，相比于傳統艾灸，熱敏灸治療效果更佳[4,9]。此外，可在IBS患者體表發現熱敏高發穴區，命門穴即為其中一個，在該穴位進行熱敏灸療法操作，可極大程度提高療效[10]。本課題組前期亦有相關實驗研究表明命門穴可有效用于IBS大鼠的治療[11]，如通過復制IBS模型大鼠，艾灸組（熱敏灸組、非熱敏灸組）于大鼠“命門穴”處行熱敏灸療法，RU-486組予以米非司酮灌胃，采用PCR方法觀察下丘腦組織CRF及腎上腺組織GR的mRNA水平、Western blot檢測下丘腦組織CRH的蛋白表達情況，結果發現相比模型組，艾灸組（熱敏灸、非熱敏灸組）IBS大鼠下丘腦組織CRF、CRH的mRNA水平及蛋白表達均降低、RU-486組表達水平升高；腎上腺組織GR的mRNA水平升高，RU-486組表達減少；且兩種組織中熱敏灸組變化最為明顯；該結果說明熱敏灸“命門穴”可通過調節CRH、CRH及GR的表達以控制HPA軸，從而有效改善IBS癥狀。付勇等[12]建立IBS大鼠模型，干預組包括熱敏灸組及非熱敏灸組，對照組包括假手術組及NMDA組，實驗過程中觀察大鼠的行為學，實驗結束后測定大鼠內臟敏感性、ELISA法檢測血清CORT表達、PCR法檢測海馬組織中GR表達水平；結果表明熱敏灸干預可下調CORT、上調GR的表達，改善IBS大鼠內臟高敏感性。

表1 ELISA法檢測大鼠血清中SP、CGRP表達（n=6）

圖2 大鼠血清SP、CGRP表達柱狀圖

圖3 大鼠結腸組織中SP、CGRP表達

圖4 大鼠結腸組織中SP、CGRP表達柱狀圖

表2 免疫組化法檢測大鼠結腸組織中SP、CGRP表達

目前，對于IBS的發病機制研究尚未明確，現代醫學研究結果表明該疾病發生與胃腸動力及內臟敏感性等因素密切相關[13]。P物質（Substance P，SP）存在于十二指腸和結腸，可刺激消化道平滑肌收縮，舒張腸黏膜血管，調節胃腸動力和腸道中水、電解質的分泌等[14]。此外，SP可傳遞感覺信息，參與內臟痛覺感受[15]。因此當患者腸道中的SP分泌異常增加時，消化道平滑肌產生強烈收縮，胃腸道增強運動，從而產生腹痛、腹瀉等癥狀。李榕嬌等[16]根據患者的疾病分型將80例IBS患者分為腹瀉組（40例）、便秘組（40例），另選擇對照組（40例結腸或胃息肉切除術后患者），觀察各組腸道菌群數量、檢測各組SP、NPY等血清指標，結果發現IBS組內的SP、NPY含量均升高，提示SP的異常升高與IBS的關聯性。此外楊梅等[17]的研究表明，溫胃調腸顆?？赏ㄟ^降低SP等相關的表達水平從而調控腦腸軸的平衡，改善IBS腹痛、腹瀉等癥狀。

降鈣素基因相關肽（Calcitonin gene related peptide，CGRP）分布于中樞、外周神經系統及消化道中，具有介導痛覺的產生及傳遞、調節胃腸道的分泌及運動等功能[18-19]。CGRP可改變內臟感覺信號傳導，將疼痛等感覺傳入中樞，導致患者胃腸動力異常及腹部疼痛等癥狀發生[19-20]。鄧多喜等[21]以合募配穴為原則對IBS大鼠行針刺治療，藥物組灌胃匹維溴胺溶液，發現針刺組可顯著下調IBS結腸組織中SP、CGRP等因子的表達以降低腸道高敏感性，減輕腹痛等癥狀；楊敏等[22]發現針灸聯合藥物治療可降低5-HT、CGRP等蛋白含量從而調節大鼠腦腸肽含量，減輕IBS相關臨床癥狀。

SP和CGRP兩者之間相互作用，可直接產生傷害性作用，抑制SP的降解，激發大量炎癥介質釋放以發生炎癥反應、參與內臟超敏反應[23-24]。

綜上所述，IBS患者出現腹痛、腹瀉的癥狀，可能與其胃腸動力異常及內臟高敏感性有緊密聯系，而SP、CGRP作為參與此類反應中的神經遞質，在該過程中有著重要調節作用。因此，想要有效治療IBS，可通過調控SP、CGRP以改善胃腸動力、降低內臟高敏感性以達到治療目的?；诖?，本次實驗通過建立IBS大鼠模型，從大鼠的精神狀況、自主活動、毛發、糞便等方面觀察各組大鼠的一般情況，過程中模型組大鼠精神活躍度降低，自主活動明顯減少，毛發枯槁易抓落，糞便時干時稀，而經熱敏灸干預后IBS大鼠一般情況有所好轉，且相比非熱敏灸組，熱敏灸組大鼠情況好轉更為明顯。除此之外，本次實驗采集大鼠血清、結腸組織，分別通過ELISA、免疫組化法檢測其血清、結腸組織中SP、CGRP的表達變化。實驗結果表明，與模型組相比，熱敏灸組及非熱敏灸組血清、結腸組織中SP、CGRP的表達均降低；與非熱敏灸組相比，熱敏灸組降低幅度更為明顯。該結果再次證明相比傳統艾灸，熱敏灸治療IBS效果更佳，且可能是通過調控SP、CGRP的表達以發揮治療作用。