二仙湯通過AMPK/mTOR通路保護早發性卵巢功能不全小鼠免受氧化應激及凋亡影響＊

周綿莉，喻小蘭，施后淵，劉 婭，王 莉

（西南醫科大學附屬中醫醫院 瀘州 646000）

早發性卵巢功能不全（Primary ovarian insufficiency，POI）是一種與不規則排卵到過早絕經相關的疾病，表現為閉經或少經并伴有促性腺激素升高和雌二醇（E2）水平下降[1]。POI可導致不孕，并與絕經后骨質疏松癥、心血管病、甚至多種惡性腫瘤有關，嚴重影響女性的生活質量[2]。目前，通常建議患有POI的女性接受長期的激素替代療法（Hormone replacement therapy，HRT），該療法可補償雌激素缺乏并有助于緩解更年期相關癥狀[3]。然而，HRT引起的規律月經不能滿足患者最迫切的需求，即恢復卵巢功能自主排卵[4]。事實上，一半以上POI患者在確診時，卵巢中還殘留著原始卵泡，這些卵泡可以間歇性地發揮作用，但對于POI患者目前還沒有經過驗證的治療方法可以恢復卵巢功能[5]。

POI屬于中醫學“月經后期”、“閉經”、“不孕”等范疇，目前尚不能被完全根治。研究顯示，中醫藥辨證治療能有效消除臨床癥狀，改善卵巢儲備功能，正成為POI極具潛力的治療方案，傳統的湯藥、現代的中成藥，治療POI均有明確的效果[6]。二仙湯是20世紀50年代由張伯納教授經過反復篩選驗證而研制出的中藥名方，由仙茅、仙靈脾、當歸、巴戟天、知母、黃柏、地骨皮及女貞子組成[7]。研究表明，二仙湯可能通過Rab-3、Rab-14等靶點改善卵巢大鼠的認知功能[8]。冒湘琳等[9]報道了二仙湯可改善卵巢儲備功能，促進卵泡正常募集和成熟。由于中藥成分的復雜性和作用多靶點性，關于二仙湯治療POI的機制研究還很缺乏，尤其關于其對POI卵巢功能改善作用的研究更少。

5’-一磷酸腺苷激活的蛋白激酶（Adenosine 5’-phosphate-activated protein kinase，AMPK）是哺乳動物細胞中的一種營養和能量感受器，調節糖脂代謝。正常生理條件下AMPK通過維持腺苷核苷酸[腺苷5’-三磷酸（ATP）、腺苷5’-二磷酸（ADP）和AMP]的動態來保護細胞免受各種代謝應激的傷害[10]。研究表明，AMPK與包括乳腺癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌和胰腺癌在內的多種疾病相關[11-12]。然而，AMPK信號在二仙湯治療POI的作用尚未完全闡明。

因此，本研究擬探討二仙湯治療POI的有效性及對AMPK/mTOR信號通路的影響，以期為二仙湯的應用治療POI提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

BABL/c雌性（SPF級）小鼠48只，7-8周齡，體質量18-22 g，購自成都達碩生物科技有限公司提供，生產許可證號：SCXK（川）2020-030，使用許可證號：SYXK（川）2019-189，自由攝食飲水，飼養于恒溫（22-25）℃，相對濕度60%±10%條件下。研究方案經西南醫科大學實驗動物倫理委員會批準（20220217-012），并按照實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑及儀器

4-乙烯基環己烯雙環氧化物（VCD，貨號：94956）購自Sigma；二仙湯（組方為仙茅、仙靈脾、當歸、巴戟天、知母、黃柏、地骨皮、女貞子）購自北京同仁堂科技股份有限公司；戊酸雌二醇片（批號：219A2）購自德國拜耳藥業；血清促卵泡生成素（FSH，貨號：ZC-38059）、雌二醇（E2，貨號：ZC-38046）、促黃體生成素（LH，貨號：ZC-38253）、活性氧（ROS，貨號：ZC-53543）、丙二醛（MDA，貨號：ZC-S0343）、超氧化物歧化酶（SOD，貨號：ZC-S0350）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px，貨號：ZC-38196）試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司；相關一抗Caspase-3（貨號：ab32150）、bax（貨號：ab81083）、bcl-2（貨號：ab32124）、AMPKα（貨號：ab32047）、p-AMPKα（貨號：ab133448）、mTOR（貨號：ab134903）、p-mTOR（貨號：ab109268）購自英國Abcam；Thermo酶標儀（MK3）上海賽默生物科技發展有限公司；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（貨號：RR820A）購自北京寶日醫生物；Western細胞裂解液（貨號：P0013）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：P0009）購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.3 早發性卵巢功能不全小鼠模型構建及分組

適應性飼養小鼠1周后，均經陰道脫落細胞涂片篩查，性周期正常。隨機挑選8只作為空白組，其余40只誘導早發性卵巢功能不全模型。造模步驟參考Hoyer等[13]的方法：造模小鼠每日腹腔注射VCD溶液5 mL·kg-1，空白組小鼠每日注射5 mL·kg-1生理鹽水，連續15天。從注射第1天起，每天早上行經陰道脫落細胞涂片檢查，根據造模小鼠動情周期紊亂或延長，判斷造模成功。

1.4 給藥方法

將造模成功后的小鼠隨機分為模型組、陽性藥物組（戊酸雌二醇片）、二仙湯低劑量組、二仙湯中劑量組、二仙湯高劑量組，每組8只。后開始灌胃給藥，陽性藥物組按每次0.3 mL給予戊酸雌二醇片水溶液，二仙湯高、中、低劑量組分別按 12 g·kg-1、8 g·kg-1、4 g·kg-1灌胃，空白組和模型組給予生理鹽水每次0.3 mL，連續6周。其中，二仙湯的制備：按10 g仙茅、10 g仙靈脾、10 g當歸、15 g巴戟天、10 g知母、10 g黃柏、15 g地骨皮、12 g女貞子分別取藥材，加入雙蒸水浸泡30 min，后煎煮、過濾、濃縮至生藥量為1.2 g·mL-1。按“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”配制低、中和高劑量藥液。戊酸雌二醇片用三蒸水溶解制成溶液，每毫升溶液含戊酸雌二醇0.009 mg。

1.5 觀察指標

1.5.1 卵巢組織病理學觀察及卵泡計數

取小鼠卵巢組織，經4%中性多聚甲醛固定24 h后，石蠟包埋切片，厚3-5 μm，HE染色，光鏡下進行形態學分析和卵泡計數，根據已發表的描述和定義卵泡被檢測并分類為原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和閉鎖卵泡[14]。

1.5.2 血清激素及卵巢組織氧化應激指標測定

通過腹主動脈采集各組小鼠血液樣品，3500 r·min-1離心15 min，收集上清液，采用試劑盒檢測小鼠的血清激素水平：E2、LH、FSH水平。取小鼠卵巢組織，將卵巢組織在冰PBS中沖洗，濾紙吸干后，剪成小塊，加入5 mL PBS在冰上用玻璃勻漿器勻漿，再進行2次反復凍融，進一步破碎細胞膜，勻漿物以5000 r·min-1離心20 min，取上清液，按試劑盒測定卵巢組織中ROS、MDA、SOD和GSH-Px的含量。

1.5.3 免疫組織化學法檢測Caspase-3、bax、bcl-2表達

固定的卵巢組織經冠狀面切成5 μm厚的連續切片，切片用含3% H2O2的過氧化物酶阻斷劑孵育30 min，以阻斷內源性過氧化物酶活性和非特異性抗原。洗滌后用正常山羊血清封閉切片15 min。隨后，用Caspase-3（1∶100）、bcl-2（1∶100）、bax（1∶100）特異性一抗孵育切片過夜。洗滌后與生物素標記的二抗在37℃孵育2 h，DAB顯色，蘇木精反染，脫水、透明，陽性細胞染成棕色，在放大倍數（40×）下每張切片計數5個視野，確定Caspase-3、bax以及bcl-2陽性染色的強度。

1.5.4 TUNEL染色檢測卵巢組織細胞凋亡

取卵巢組織，用4%多聚甲醛固定24 h后，包埋，連續切片，厚度5 μm，TUNEL染色觀察卵巢組織細胞凋亡情況。

1.5.5 qRT-PCR檢測AMPKα、mTOR mRNA表達

應用TRIzol試劑卵巢組織中提取RNA，將mRNA反轉錄為cDNA。使用TB Green PreMix ex Taq II試劑盒進行實時PCR。以β-actin為內參。引物序列：AMPKα：上游引物5’-CAGTGATGAGGTGGTGGAGCA GAGGT-3’，下游引物5’-GTGAATGGTTCTCGGCTGT GCTGGAA-3’；mTOR：上游引物5’-AGAGGACCAGC AGCACAAGCAGGA-3’，下游引物5’-TGGTGCAGTGG TGGTGGCATT-3’；β-actin：上游引物5’-AGCGGGAA ATCGTGCGTGAC-3’，下游引物5’-ACTCCTGCTTGCT GATCCACATC-3’。以95℃ 10 min，95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s條件進行PCR反應，45個循環，記錄CT值，2-ΔΔCT分析相對表達水平。

1.5.6 Western blot檢測AMPKα、p-AMPKα、mTOR、p-mTOR蛋白表達

將卵巢組織勻漿于放射免疫沉淀分析緩沖液（RIPA）中，在4℃下5000 r·min-1離心后，收集上清液，用BCA試劑盒檢測蛋白質濃度，然后在95℃變性5 min。將等量的蛋白質負載到8%的SDS-PAGE凝膠上，通過電泳分離并轉移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫孵育1 h后，分別與抗AMPKα、p-AMPKα、mTOR、p-mTOR（均1：500）或β-actin（1∶1000）在4℃孵育過夜，再與辣根過氧化物酶偶聯二抗在室溫下孵育2 h，ECL檢測免疫反應條帶，化學發光成像系統采集圖像，Image J軟件分析光密度，以β-actin為內參，對照組目標蛋白質相對含量為1，計算各組蛋白質的相對表達量。

1.6 統計學分析

使用SPSS 22.0進行數據統計分析，數據表示為平均值±標準差（），兩組間均數比較采用LSD-t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 二仙湯對早發性卵巢功能不全小鼠卵巢組織病理學、卵泡計數的影響

空白組卵泡的顆粒細胞層排列規則，無明顯變化；模型組卵泡的顆粒細胞層排列紊亂，各級生長卵泡數量減少、閉鎖卵泡數量增多。與模型組比較，4個治療組的卵泡顆粒細胞排列較為規則，大多卵泡結構較為完整，治療后各級生長卵泡數量增多、閉鎖卵泡數量減少，其中二仙湯高劑量組對卵巢形態及卵泡數顯示出更明顯的改善作用。如圖1。

2.2 二仙湯對早發性卵巢功能不全小鼠血液激素水平的影響

與空白組比較，模型組E2含量明顯降低，LH、FSH含量明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，僅二仙湯高劑量組均明顯升高E2含量，明顯降低LH、FSH含量（P＜0.05）。見表1。

2.3 二仙湯對早發性卵巢功能不全小鼠氧化應激的影響

與空白組比較，模型組ROS、MDA含量明顯升高，SOD、GSH-Px活性明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，戊酸雌二醇組、二仙湯高劑量組ROS含量明顯降低，GSH-Px活性明顯升高（P＜0.05）；二仙湯高劑量組ROS、MDA含量明顯降低，SOD、GSH-Px活性明顯升高（P＜0.05）。見表2。

圖1 各組小鼠組織病理變化及卵泡計數（HE染色）

表1 各組小鼠血清E2、LH、FSH、AMH含量變化

2.4 二仙湯對早發性卵巢功能不全小鼠組織細胞凋亡的影響

免疫組化結果顯示，與空白組比較，模型組Caspase-3、bax表達明顯增加，bcl-2表達明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，戊酸雌二醇組、二仙湯低、中、高劑量組Caspase-3表達明顯降低，bcl-2表達明顯升高（P＜0.05），二仙湯高劑量組 bax表達明顯降低（P＜0.05）；與戊酸雌二醇組比較，二仙湯高劑量組bax表達明顯降低（P＜0.05）。（圖2A，2C）。TUNEL熒光染色結果顯示，與空白組比較，模型組細胞凋亡明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，戊酸雌二醇組、二仙湯低、中和高劑量組細胞凋亡被明顯抑制（P＜0.05）。（圖2B，2C）。

2.5 二仙湯對早發性卵巢功能不全小鼠AMPK/mTOR信號通路的影響

qRT-PCR檢測結果顯示，與空白組比較，模型組AMPKα、mTOR mRNA表達明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，二仙湯高劑量組AMPKα、mTOR mRNA表達明顯升高（P＜0.05）。Western blot檢測結果顯示，與空白組比較，模型組AMPKα、mTOR蛋白表達無明顯差異統計學意義（P＞0.05），p-AMPKα、p-mTOR蛋白表達明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，治療組AMPKα、mTOR蛋白表達無明顯差異統計學意義（P＞0.05），二仙湯中、高劑量組p-AMPKα和p-mTOR蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。見圖3。

表2 各組小鼠卵巢組織ROS、MDA、SOD、GSH-Px含量

圖2 各組小鼠細胞凋亡比較

圖3 各組小鼠卵巢組織AMPK/mTOR通路相關因子變化

3 討論與結論

3.1 二仙湯治療改善POI卵巢功能及氧化應激

卵泡計數是卵巢功能的重要指標，研究顯示，卵泡衰竭是由宮內期原始卵泡池形成不足、卵泡消耗增加、自身免疫性或中毒性卵泡降解引起的，且當卵巢卵泡的正常功能被病理過程阻斷時將會發生卵泡功能障礙[15]。本研究結果顯示，POI小鼠卵巢內卵泡的顆粒細胞層排列紊亂，原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡較空白組減少，而閉鎖卵泡數量呈現增加，二仙湯可改善此現象。此外，卵巢功能還主要體現在內分泌和生殖功能上，抗苗勒氏管激素可抑制顆粒細胞對FSH的敏感性，從而在優勢卵泡選擇中發揮作用[16]。此外，氧化應激與女性和男性的逆行生殖病例的病因有關[17]，ROS水平較高的卵巢功能早衰患者中服用輔酶Q可以改善胚胎質量[18]，提出氧化應激的增加與卵巢功能早衰相關的卵巢炎有關[19]，且高ROS水平導致線粒體異常，可能會導致因氧化磷酸化和卵子生成紊亂而產生低的三磷酸腺苷、卵細胞數量減少以及卵巢功能早衰[20]。在本研究中，POI小鼠LH、FSH、ROS、MDA 含量明顯升高、E2含量及SOD、GSH-Px活性明顯降低；二仙湯高劑量可逆轉上述因子水平。與A?a?ayak等[21]的研究報道一致，證明POI小鼠出現動情周期紊亂，卵巢功能損害，氧化應激指數升高，二仙湯可改善POI小鼠的卵巢功能及氧化應激水平。

3.2 二仙湯治療可抑制POI細胞凋亡及激活AMPK/mTOR信號通路

細胞凋亡在女性生殖系統的生長和發育中起重要作用，不同的應激刺激可導致細胞凋亡，證據表明，ROS的產生可誘導細胞凋亡[22]。然而，目前為止還沒有研究探討二仙湯對POI誘導的細胞凋亡的抑制作用。雖然細胞凋亡的作用和機制仍然存在許多問題，但證據證實，細胞凋亡與mTOR信號通路調節密切相關。此外，AMPK介導的mTOR激活抑制了卵泡閉鎖期間卵巢顆粒細胞的凋亡[23]。AMPK/mTOR信號通路參與凋亡、自噬和細胞存活，AMPK的激活可以抑制mTOR的磷酸化，而mTOR可以通過調節下游信號分子來阻斷細胞凋亡，如抑制Caspase-9的激活，以及滅活bcl-2家族成員[24]。Liu等[25]研究發現AMPK/mTOR信號通路可能激活了壬基酚誘導的大鼠卵巢顆粒細胞凋亡和自噬。且證據表明，AMPK信號通路可被氧化應激激活[25]。另外，mTOR激活mTORC1并增加下游基因Rheb、S6k1、4E-BP1的表達來增強卵母細胞內的蛋白轉錄進而促進卵泡的發育[26]。雌激素能夠激活AMPK，導致E2和LH水平變化，進一步反饋性調節FSH、LH分泌[27]。本研究結果顯示，POI小鼠卵巢中Caspase-3、bax表達及細胞凋亡明顯升高，bcl-2表達、AMPKα、mTOR mRNA及p-AMPKα、p-mTOR蛋白表達明顯降低；二仙湯高劑量組Caspase-3、bax表達及細胞凋亡明顯降低，bcl-2表達、AMPKα、mTOR mRNA 及 p-AMPKα、pmTOR蛋白表達明顯升高。提示二仙湯能夠抑制POI卵巢組織細胞凋亡及刺激AMPK/mTOR通路顯著激活。

綜上所述，二仙湯可改善早發性卵巢功能不全小鼠的卵巢功能及氧化應激，其保護作用可能是由AMPK/mTOR信號通路介導的，然而，尚需要更多的研究來確定二仙湯對POI的改善作用，特別是二仙湯的多靶點作用，可能為未來POI治療的潛在方向，也為今后基于網絡藥理學分析，系統綜合地觀察二仙湯對POI的干預與影響奠定基礎。