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扭傷歸膠囊的質量標準提升

2022-03-29 23:35:13黃萍馮有龍周娟娟時佩史清水
中國藥房 2022年6期

黃萍 馮有龍 周娟娟 時佩 史清水

中圖分類號 R927.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408(2022)06-0718-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.06.12

摘 要 目的 為提高扭傷歸膠囊的質量標準提供參考。方法 在現行質量標準的基礎上,建立扭傷歸膠囊中白芷和知母的薄層色譜(TLC)鑒別方法,建立同時測定芒果苷、升麻素苷、柚皮苷、新橙皮苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷5種成分含量的高效液相色譜(HPLC)法并確定限度。結果 扭傷歸膠囊供試品TLC圖中,在與相應(混合)對照品或白芷、知母對照藥材相同位置上,均顯相同顏色的斑點,且陰性對照無干擾。芒果苷、升麻素苷、柚皮苷、新橙皮苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷檢測質量濃度的線性范圍分別為7.98~127.63、6.74~107.84、53.06~848.96、39.31~628.90、13.54~216.62 μg/mL(r均為0.999 9);精密度、穩定性(24 h)、重復性試驗的RSD均不高于1.20%(n=6),平均加樣回收率分別為95.00%、105.16%、97.16%、101.00%、104.97%(RSD≤1.50%,n=6)。4批樣品中,上述5種成分的平均含量分別為0.842、0.696、6.951、5.755、1.106 mg/g,方中知母、防風、枳殼分別以芒果苷含量、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷總量、柚皮苷和新橙皮苷總量計不得少于0.42、0.90、6.36 mg/粒。結論 本研究建立了扭傷歸膠囊中白芷、知母的TLC鑒別方法及芒果苷等5種成分的含量測定方法,并確定了方中知母、防風、枳殼的限度。

關鍵詞 扭傷歸膠囊;鑒別;含量測定;質量標準提升

Study on the improvement of quality standard for Niushanggui capsules

HUANG Ping1,FENG Youlong2,ZHOU Juanjuan2,SHI Pei1,SHI Qingshui2(1. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China; 2. Jiangsu Institute for Food and Drug Control, Nanjing 210019, China)

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To provide reference for the improvement of the quality standard for Niushanggui capsules. METHODS Based on the previous quality standard, thin-layer chromatography (TLC) identification methods were established for Angelicae dahurica and Anemarrhenae asphodeloides. High performance liquid chromatography (HPLC) method was established to determine the contents of 5 components simultaneously, such as mangiferin, prim-O-glucosylcimifugin, naringin, neohesperidin and 5-O-methylvisammioside. The limits were confirmed. RESULTS TLC chromatogram of Niushanggui capsules showed the same color spots in the same position as the corresponding (mixed) substance control or reference medicinal material of A. dahuricae and A. asphodeloides, while the negative samples had no interference. The linear range of mangiferin, prim-O-glucosylcimifugin, naringin, neohesperidin and 5-O-methylvisammioside were 7.98-127.63, 6.74-107.84, 53.06-848.96, 39.31-628.90, 13.54-216.62 μg/mL, respectively(all r=0.999 9). RSDs of precision, stability (24 h) and repeatability tests were all no more than 1.20% (n=6). The average recoveries were 95.00%, 105.16%, 97.16%, 101.00% and 104.97% (RSD≤1.50%, n=6). In 4 batches of samples, the average contents of the above 5 components were 0.842, 0.696, 6.951, 5.755 and 1.106 mg/g respectively; the limits of A. asphodeloides, Saposhnikovia divaricata and Citrus aurantium were based on the contents of mangiferin, the total content of prim-O-glucosylcimmifugin and 5-O-methylvisammioside, naringin and neohesperidin, which would not be less than 0.42, 0.90 and 6.36 mg/grain, respectively. CONCLUSIONS TLC identification methods of A. dahurica and A. asphodeloides and the content determination methods of 5 components as mangiferin in Niushanggui capsules are established in this study, and the limits of A. asphodeloides, S. divaricata and C. aurantium are confirmed.

KEYWORDS? ?Niushanggui capsules; identification; content determination; improvement of quality standard

扭傷歸膠囊由當歸、防風、枳殼、浙貝母、知母、天南星(制)、瓜萎、白芷、紅花9味藥組成,具有理氣、活血化瘀、消腫止痛的作用,常用于胸肋、腰背、四肢等軟組織急性損傷。方中當歸乃血中之氣藥,蓋氣調則血和,故有血滯能通、血虛能補、血枯能潤、血亂能接之功;防風、天南星(制)為祛風散血、除疾之要藥;枳殼有破氣行疾,開胃健脾之功;浙貝母、知母、瓜蔞能清肺、瀉火、化痰,有潤肺止咳之效;白芷能散風除濕、芳香通竅;紅花有破瘀之功,瘀行則血活。

扭傷歸膠囊現行質量標準為原國家食品藥品監督管理總局頒布的國家藥品標準YBZ08332006-2015,但僅包含了當歸、防風、枳殼、紅花4味藥的薄層色譜(thin-layer chromatography,TLC)鑒別和浙貝母中貝母素甲、貝母素乙的高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)含量測定,缺少其余藥味的定性和定量分析,難以全面評價該制劑的質量[1]。方中防風具有祛風、解表、勝濕、止痙之功效,其所含色原酮類化合物(如升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷)是全方發揮解熱鎮痛和抗炎作用的主要活性成分[2-4];枳殼具有理氣寬中、行滯消脹等功效,柚皮苷和新橙皮苷是其代表性成分[5-6];芒果苷為知母的主要活性成分,具有清熱瀉火、滋陰潤燥的功效[7-8];白芷的主要成分為歐前胡素和異歐前胡素,具有解表散寒,祛風止痛、消腫排膿之功效,臨床上多用于抗炎、鎮痛[9]。鑒于此,本課題組按照國家藥典委員會國家藥品標準提高研究課題(No.YBZ08332006-2015)任務書有關要求,在現行質量標準的基礎上,采用TLC法對扭傷歸膠囊中白芷、知母進行定性鑒別,并運用HPLC法測定其中芒果苷、升麻素苷、柚皮苷、新橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷5種成分的含量,使其質量可控性更強、檢驗標準更加全面和完善,為綜合評價該制劑質量提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括1260 InfinityⅡ型HPLC儀及配備的二極管陣列檢測器(美國Agilent公司)、BS21S型電子天平(德國Sartorius公司)、XP6型電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)、KH-700TDB型高頻數控超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)、VISUALIZER型TLC數碼成像儀(瑞士Camag公司)等。

1.2 主要藥品與試劑

扭傷歸膠囊(批號分別為181101、190901、190902、210481,規格均為每粒裝0.5 g)以及缺白芷陰性對照樣品、缺知母陰性對照樣品、缺防風陰性對照樣品、缺枳殼陰性對照樣品均由無錫濟民可信山禾藥業股份有限公司提供;升麻素苷對照品(批號111522-201712,純度94.6%)、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品(批號111523-201811,純度97.4%)、柚皮苷對照品(批號110722-201815,純度91.7%)、新橙皮苷對照品(批號111857-201703,純度99.4%)、芒果苷對照品(批號111607-201704,純度98.1%)、歐前胡素對照品(批號110826-201616,純度99.6%)、異歐前胡素對照品(批號110827-201812,純度99.6%)、白芷對照藥材(批號120945-201510,供鑒別使用)、知母對照藥材(批號121070-201806,供鑒別使用)均購自中國食品藥品檢定研究院;硅膠G薄層板(規格100 mm×100 mm)購自青島海洋化工有限公司;聚酰胺薄膜(規格10 cm×20 cm)購自浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠;甲醇和磷酸均為色譜純,其余試劑均為分析純,水為超純水。

2 方法與結果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 白芷藥材的TLC鑒別 取扭傷歸膠囊內容物適量,混勻,研細,取2 g,加乙醚10 mL,浸泡1 h并時時振搖,濾過,濾液揮干,殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解,作為供試品溶液。取缺白芷陰性對照樣品,按上述方法操作,制成缺白芷陰性對照溶液。另取白芷對照藥材粉末(過三號篩)0.5 g,按上述方法操作,制成白芷對照藥材溶液。再分別取歐前胡素、異歐前胡素對照品適量,加乙酸乙酯溶解、稀釋,制成質量濃度均為2 mg/mL的混合對照品溶液。按照2020年版《中國藥典》(四部)通則“0502薄層色譜法”相關要求[10],吸取歐前胡素、異歐前胡素混合對照品溶液,缺白芷陰性對照溶液,白芷對照藥材溶液,供試品溶液各4 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以石油醚(30~60 ℃)-乙醚(3 ∶ 2,V/V)為展開劑,展開,取出,晾干,置于紫外光燈(365 nm)下檢視,結果見圖1。由圖1可見,供試品色譜中,在與白芷對照藥材色譜和歐前胡素、異歐前胡素混合對照品色譜相應的位置上,均顯相同顏色的熒光斑點,且缺白芷陰性對照無干擾。

2.1.2 知母藥材的TLC鑒別 取扭傷歸膠囊內容物適量,混勻,研細,取2 g,加稀乙醇10 mL,超聲(功率250 W,頻率40 kHz)處理20 min,過濾,取續濾液作為供試品溶液。取缺知母陰性對照樣品,按上述方法操作,制成缺知母陰性對照溶液。另取知母對照藥材粉末(過三號篩)0.5 g,按上述方法操作,制成知母對照藥材溶液。再取芒果苷對照品適量,加稀乙醇溶解、稀釋,制成質量濃度為0.5 mg/mL的對照品溶液。按照2020年版《中國藥典》(四部)通則“0502薄層色譜法”相關要求[10],吸取芒果苷對照品溶液、缺知母陰性對照溶液、知母對照藥材溶液、供試品溶液各1 μL,分別點于同一聚酰胺薄膜上,以乙醇-水(3 ∶ 1,V/V)為展開劑,展開,取出,晾干,置于紫外光燈(365 nm)下檢視,結果見圖2。由圖2可見,供試品色譜中,在與知母對照藥材色譜和芒果苷對照品色譜相應的位置上,均顯相同顏色的熒光斑點,且知母陰性對照無干擾。

2.2 含量測定

2.2.1 混合對照品貯備溶液的制備 取芒果苷、升麻素苷、柚皮苷、新橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品各適量,加50%甲醇制成質量濃度分別為127.63、107.84、848.96、628.90、216.62 μg/mL的混合對照品貯備溶液,備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取扭傷歸膠囊內容物適量,研細,混勻,取約1.0 g,精密稱定,置于25 mL量瓶中,加50%甲醇20 mL,超聲(功率250 W,頻率40 kHz)處理30 min,放冷,加50%甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續濾液,即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 分別取缺防風、缺知母、缺枳殼陰性對照樣品各1.0 g,按照“2.2.2”項下方法操作,制成相應的陰性對照溶液。

2.2.4 色譜條件 以Agela Durashell C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)為色譜柱,以甲醇(A)-0.1%磷酸溶液(B)為流動相進行梯度洗脫(0~5 min,20%A;5~15 min,20%A→33%A;15~36 min,33%A→45%A;36~50 min,45%A→55%A;50~55 min,55%A→70%A;55~60 min,70%A→20%A);流速為1.0 mL/min;柱溫為35 ℃;檢測波長為254 nm(芒果苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷)、280 nm(柚皮苷、新橙皮苷);進樣量為10 μL。

2.2.5 專屬性考察 分別吸取“2.2.1”~“2.2.3”項下混合對照品貯備溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL,按“2.2.4”項下色譜條件進樣測定,記錄色譜圖,詳見圖3。由圖3可見,在該色譜條件下,供試品溶液的理論板數按芒果苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷峰計均不低于10 000,相鄰色譜峰間的分離度均大于1.5;同時,供試品色譜中,在與對照品色譜相同保留時間處檢出色譜峰,方中其他成分對芒果苷、升麻素苷、柚皮苷、新橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的測定均無干擾。

2.2.6 線性關系考察 取“2.2.1”項下混合對照品貯備溶液,用50%甲醇稀釋,制成芒果苷質量濃度分別為7.98、15.95、31.91、63.81、127.63 μg/mL,升麻素苷質量濃度分別為6.74、13.48、26.96、53.92、107.84 μg/mL,柚皮苷質量濃度分別為53.06、106.12、212.24、424.45、848.96 μg/mL,新橙皮苷質量濃度分別為39.31、78.61、157.23、314.45、628.90 μg/mL,5-O-甲基維斯阿米醇苷質量濃度分別為13.54、27.08、54.15、108.31、216.62 μg/mL的系列混合對照品溶液,按“2.2.4”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積。以待測成分的峰面積(y)為縱坐標、質量濃度(x)為橫坐標進行回歸分析,得回歸方程,結果見表1。

2.2.7 檢測限和定量限考察 取“2.2.6”項下最低質量濃度的混合對照品溶液,用50%甲醇逐級稀釋,按照“2.2.4”項下色譜條件進樣測定,以信噪比10 ∶ 1測得定量限,以信噪比3 ∶ 1測得檢測限。結果顯示,芒果苷、升麻素苷、柚皮苷、新橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的定量限分別為0.06、0.16、0.18、0.16、0.24 μg/mL,檢測限分別為0.02、0.05、0.05、0.05、0.07 μg/mL。

2.2.8 精密度試驗 取“2.2.6”項下芒果苷、升麻素苷、柚皮苷、新橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷質量濃度分別為31.91、26.96、212.24、157.23、54.15 μg/mL的混合對照品溶液,按照“2.2.4”項下色譜條件重復進樣測定6次,記錄峰面積。結果顯示,芒果苷、升麻素苷、柚皮苷、新橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD分別為0.40%、0.42%、0.30%、0.31%、0.26%(n=6),表明儀器精密度良好。

2.2.9 穩定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液(批號181101),分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按照“2.2.4”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積。結果顯示,芒果苷、升麻素苷、柚皮苷、新橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD分別為0.24%、1.20%、0.20%、0.25%、1.15%(n=6),表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.2.10 重復性試驗 精密稱取扭傷歸膠囊(批號181101)內容物1.0 g,共6份,分別按照“2.2.2”項下方法制成供試品溶液,再按照“2.2.4”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積并代入回歸方程計算各成分的含量。結果顯示,芒果苷、升麻素苷、柚皮苷、新橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的平均含量分別為0.974、0.673、6.504、4.577、1.181 mg/g,RSD分別為1.03%、0.27%、0.38%、0.39%、0.36%(n=6),表明方法重復性良好。

2.2.11 加樣回收率試驗 稱取已知含量的扭傷歸膠囊(批號181101)內容物約0.5 g,精密稱定,共6份,分別置于25 mL量瓶中,加入芒果苷、升麻素苷、柚皮苷、新橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷質量濃度分別為0.516 6、0.311 7、3.175 5、2.324 7、0.546 9 mg/mL的混合對照品溶液(配制方法同“2.2.1”項)1 mL,按照“2.2.2”項下方法制成供試品溶液,再按照“2.2.4”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積并計算加樣回收率,結果見表2。

2.2.12 樣品含量測定 取4批扭傷歸膠囊樣品適量,分別按照“2.2.2”項下方法制成供試品溶液,再按照“2.2.4”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積并代入回歸方程計算各成分的含量,重復測定2次,計算平均值,結果見表3。

2.3 限度確定

由表3可見,4批扭傷歸膠囊中芒果苷、升麻素苷、柚皮苷、新橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的平均含量分別為0.842、0.696、6.951、5.755、1.106 mg/g。根據芒果苷轉移率=成藥中芒果苷的含量/(知母中芒果苷的含量×知母的處方量)×100%計算,得芒果苷的轉移率最低為9.8%、最高為21.8%,平均值為18.8%。暫將芒果苷的限度設定為知母最低含量×處方量×平均轉移率,即0.42 mg/粒,綜合考慮,扭傷歸膠囊含知母以芒果苷(C19H18O11)計不得少于0.42 mg/粒。同上,扭傷歸膠囊含防風以升麻素苷(C22H28O11)和5-O-甲基維斯阿米醇苷(C22H28O10)總量計不得少于0.90 mg/粒,含枳殼以柚皮苷(C27H32O14)和新橙皮苷(C28H34O15)總量計不得少于6.36 mg/粒。

3 討論

3.1 藥材的選擇

扭傷歸膠囊原質量標準YBZ08332006有3項理化鑒別,但方法專屬性較差,在現行質量標準YBZ08332006- 2015中已被刪除,增加了紅花的TLC鑒別,對知母、天南星(制)、白芷未涉及。本研究在現行質量標準的基礎上,增加了知母和白芷的TLC鑒別,同時采用HPLC法對防風、枳殼、知母進行了含量測定,以達到同時控制方中不同藥味的目的,為進一步提高扭傷歸膠囊的質量標準提供參考。

3.2 TLC鑒別藥材和方法的選擇

扭傷歸膠囊由9味藥組成,成分復雜,現行標準質控不夠全面,缺少白芷、知母、天南星(制)等關鍵藥味的質控項目,故十分有必要建立上述藥材的TLC鑒別方法以控制藥品的整體質量。本研究參考2020年版《中國藥典》(一部)“白芷”“知母”鑒別項下的方法建立了扭傷歸膠囊中這兩味藥的TLC鑒別方法[11]。結果顯示,供試品色譜中,與對照藥材和(混合)對照品色譜相應位置上均顯相同顏色的斑點,且陰性對照無干擾。在方法學研究中,筆者比較了不同廠家的薄層板以及在不同溫度、不同濕度下的展開情況,結果表明,各色譜斑點及分離度均符合2020年版《中國藥典》(四部)通則“0502薄層色譜法”的相關要求[10],且耐用性良好。此外,本課題組還對天南星(制)進行了TLC鑒別研究,但陰性對照有干擾,經過多次實驗后仍未能找到適宜的展開條件,故未將其TLC鑒別方法列入正文中。

3.3 HPLC流動相的選擇

通過查閱相關文獻[12-15],本課題組考察了甲醇-0.1%醋酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%醋酸溶液3種流動相系統的分離效果。結果顯示,以甲醇-0.1%磷酸溶液為流動相時,5種待測成分的出峰時間、峰形及峰純度最優,故采用甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動相。

3.4 HPLC檢測波長的選擇

本課題組前期采用二極管陣列檢測器進行全波長掃描,發現芒果苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷在254 nm波長處有最大吸收,柚皮苷、新橙皮苷在280 nm波長處有最大吸收,故選擇254、280 nm作為檢測波長。

3.5 HPLC供試品溶液提取條件的選擇

本課題組前期分別考察了超聲、冷浸、加熱回流等不同提取方式的提取效果,結果表明,超聲處理的提取效果最好,故最終確定以超聲作為供試品溶液的提取方式。本課題組前期還考察了提取溶劑(50%甲醇、70%甲醇、甲醇、乙醇、正丁醇)、超聲時間(20、30、50 min)、取樣量(1.0、2.0、4.0 g)對提取效果的影響,結果顯示,取1 g樣品加50%甲醇超聲提取30 min的效果最好。

3.6 不足

本方中天南星(制)為有毒中藥,在實驗設計中有TLC鑒別和含量測定研究內容。但在TLC鑒別研究中,本課題組嘗試了多種供試品溶液制備方法:60%乙醇超聲處理、甲醇超聲處理、乙醇冷浸處理、乙醇加熱回流、石油醚索氏提取等;同時,本課題組也嘗試了多種展開劑和顯色劑,均未得到理想結果[未找到天南星(制)的特征斑點]。此外,本課題組還嘗試采用HPLC法對天南星(制)進行鑒別和含量測定研究,但均未能找到特征峰。鑒于此,此次標準提升未涉及天南星(制)相關檢驗項目。

本課題組在前期實驗中設計了當歸指標性成分阿魏酸的含量測定項,但實驗結果顯示,阿魏酸的含量較低,色譜峰響應極弱且陰性對照有干擾,雖反復優化供試品溶液的制備方法和色譜條件,仍未能消除陰性對照的干擾,考慮到現行質量標準已收載當歸的TLC鑒別項,故此次多成分含量測定未納入阿魏酸。

綜上所述,本研究在扭傷歸膠囊現行質量標準的基礎上,增加了白芷、知母的TLC鑒別項,擴展了含量測定項的指標性成分,建立了可同時測定扭傷歸膠囊中芒果苷、升麻素苷、柚皮苷、新橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷含量的新方法。但由于本研究樣品批次偏少(只有4批),后期將進一步積累數據,在此基礎上制訂上述各成分的合理含量限度。

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(收稿日期:2021-12-06 修回日期:2022-02-10)

(編輯:鄒麗娟)

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