ddPCR與ARMS-PCR檢測NSCLC患者EGFR基因T790M突變的比較研究*

李月，徐玉霞

510060廣州，中山大學腫瘤防治中心 華南腫瘤學國家重點實驗室，腫瘤醫學協同創新中心

肺癌是全球發病率最高的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占80%～85%[1-2]。近年來的研究發現，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)對攜帶EGFR敏感突變的NSCLC患者具有顯著療效[3]。然而，患者通常在接受一/二代TKI靶向治療后10～16個月時會不可避免地發生獲得性耐藥[4]。EGFR基因第20號外顯子發生的T790M錯義突變約占所有獲得性耐藥機制的50%～60%[5-7]。第三代TKI奧希替尼可針對T790M錯義突變，為患者帶來約38個月的無進展生存[8]，對原發T790M突變患者也具有治療效果[9-10]。因此，在EGFR-TKI治療開始前和治療過程中，對NSCLC患者進行EGFR基因T790M突變檢測和動態監測,對于及時發現耐藥和調整治療方案十分重要。

突變擴增阻滯系統PCR(amplification refractory mutation system PCR,ARMS-PCR)利用引物的3’端堿基與模板堿基若不互補則無法延伸的原理，使引物3’端堿基分別與突變和正常的模板堿基互補，從而將有某種點突變的模板與正常模板區分開來，此方法已廣泛用于包括EGFR在內多種基因的熱點突變檢測，靈敏度可達1.0%，方便快捷，應用廣泛。微滴式數字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)又稱第三代PCR，基本原理是將一個樣本分到幾百到幾萬個不同的反應單元，每個微滴單元包含一個或多個拷貝的DNA模板，所有單元同時對目標分子進行擴增，然后根據泊松分布原理統計和定量，是一種無需引入標準曲線、無需受擴增效率影響的絕對定量技術，不僅兼具ARMS-PCR操作便捷、實驗周期短的優點，而且具有更高的敏感性，檢測下限可低至0.1%，樣本用量少，尤其適合檢測外周血循環游離DNA(circulating cell-free DNA,cfDNA)樣本。

此外，目前分子診斷領域檢測EGFR基因T790M突變的方法還有Sanger測序、二代測序法(next-generation sequencing,NGS)等[11-12]。Sanger測序是最早應用于EGFR基因突變檢測的技術之一，此方法雖然成本低，特異性高，但對標本的質量要求較高，實驗操作過程繁瑣、耗時長，且敏感性低。因需提前針對目標序列設計引物，Sanger測序與ARMS-PCR、ddPCR一樣都只能檢測已知位點的突變。近年來迅速崛起的NGS技術可一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行測序，檢測通量高、變異類型覆蓋全面，不僅可以檢測到未知突變，還可以評估患者的腫瘤突變負荷和微衛星不穩定狀態。但因NGS實驗流程復雜、檢測成本高、報告周期長等因素，一般不被臨床作為單基因熱點突變檢測的首選方法。本研究回顧性收集NSCLC患者組織、胸水脫落細胞、外周血cfDNA樣本，同時采用ARMS-PCR和ddPCR方法檢測T790M突變，以對比兩種方法的檢測效能和適宜樣本類型，以期為臨床及病理醫生在選擇檢測技術方面提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 樣本

回顧性收集中山大學腫瘤防治中心分子診斷科行ddPCR檢測EGFR基因T790M突變的NSCLC標本551例，其中同時采用ddPCR和ARMS-PCR兩種方法檢測的樣本115例(石蠟包埋組織56例，胸水脫落細胞12例，外周血47例)。所有病例均經組織病理學確診為NSCLC，本研究經本中心醫學倫理學委員會批準，所有患者及家屬均已簽署書面知情同意。

1.2 試劑與儀器

組織及胸水脫落細胞基因組DNA按照QIAGEN DNA FFPE Kit (QIAGEN，德國)說明書進行提取，并采用NanoDrop2000(NanoDrop Technologies,美國)紫外分光光度計對核酸進行濃度測定。外周血cfDNA按照QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN，德國)說明書提取，并使用Qubit ssDNA Assay Kit及Qubit 3.0熒光定量儀測定濃度。ARMS-PCR檢測使用人EGFR基因突變檢測試劑盒(PCR-熒光探針法，北京鑫諾美迪醫學科技有限公司，國械注準20143402145)，PCR反應使用ABI 7500熒光定量PCR儀(ThermoFisher Scientific，美國)。ddPCR按照人EGFR基因T790M檢測試劑盒(上海源奇生物醫藥科技有限公司，滬食藥監械生產許20111877號)說明書操作，使用Bio-Rad QX200 數字PCR儀(Bio-Rad，美國 )進行檢測，通用試劑耗材均為伯樂公司原裝進口。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 常規石蠟包埋組織切片：HE染色后觀察腫瘤細胞在切片中所占比，選取腫瘤細胞大于60%區域富集至潔凈的EP管中；胸水標本：低速離心收集胸水細胞沉渣。按照FFPE DNA Kit試劑盒說明書提取基因組DNA。采用NanoDrop2000測定核酸濃度。外周血采集使用cfDNA保護EDTA抗凝管，采血量8～10 mL，1 600×g離心10 min分離血漿，16 000×g離心10 min后吸取上清，置于-80 ℃保存(血漿需在采血后2 h內完成分離)。按照Circulating Nucleic Acid Kit試劑盒說明書提取cfDNA。外周血cfDNA核酸濃度采用Qubit3.0熒光定量儀測定。

1.3.2 ARMS-PCR和ddPCR檢測T790M突變 ARMS-PCR：按試劑盒說明書配制PCR反應體系，將DNA稀釋至10 ng/μL加入PCR體系后上機檢測，PCR運行程序：37 ℃ 2 min；95 ℃ 3 min；(94 ℃ 15 s，60 ℃ 35 s)×45個循環；25 ℃ 1 min。ddPCR：cfDNA樣本按照試劑盒說明書取15 μL進行預擴增后取1 μL預擴增PCR產物稀釋至6 μL、組織及胸水脫落細胞標本DNA測定濃度后稀釋至10 ng/μL后取6 μL加入到PCR反應體系中，將含有樣品的20 μL DNA反應液置于微滴發生器的樣品孔中，加入70 μL微滴生成油至油孔后放置于微滴生成儀中生成納升級的油包水液滴。微滴生成后轉入96孔板中用鋁箔熱封膜密封，封膜后進行PCR擴增反應，擴增程序：95 ℃ 10 min;(94 ℃ 15 s, 58 ℃ 60 s)×40個循環；98 ℃ 10 min; 4 ℃ hold(注意升降溫度≤2 ℃/s)。PCR反應結束后將反應板置于微滴讀取儀上，打開QuantaSoft軟件進行微滴熒光檢測和數據分析。當樣本中至少有3個微滴出現在FAM信號的陽性區域時，認為該樣本T790M突變陽性。0～1個陽性微滴判為陰性，2個時需重復檢測。

1.4 統計學分析

采用SPSS 23.0統計學軟件進行分析。計數資料差異性分析采用χ2檢驗進行比較，兩組間數據比較采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析,P<0.05為差異有統計學意義，使用GraphPad Prism 8軟件進行圖表制作。

2 結 果

2.1 臨床資料

本研究共納入115例患者，其中男性53例，女性62例，年齡范圍34～87歲，中位年齡61歲。病理學分型包括腺癌111例、鱗癌2例、其他類型NSCLC 2例。有明確的組織學分級的有71例，其中低分化者38例、中分化32例、高分化1例。63例可明確TNM分期，其中處于Ⅰ～Ⅱ期7例，處于Ⅲ～Ⅳ期56例。92例伴有EGFR基因敏感突變，其中19-del和L858R分別占比36.9%(34/92)和46.7%(43/92)。T790M突變狀態與臨床病理參數關系見表1。

表1 T790M基因突變與NSCLC患者臨床病理關系

ParameterNT790M mutationT790M+T790M-χ2PPathology4.0570.132 Adenocarcinoma1117437 Squamous carcinoma211 Others202TNM stage39.265<0.001 Ⅰ+Ⅱ761 Ⅲ+Ⅳ56515 Uncertain521834EGFR mutations35.699<0.001 19del35269 L858R453510 Other mutations12111 Wild type23320

2.2 ARMS-PCR和ddPCR檢測T790M突變結果比較

115例NSCLC患者標本中，ARMS-PCR檢測T790M突變陽性32例，陽性率27.8%。ddPCR檢測T790M突變陽性75例，平均陽性微滴數和平均突變豐度分別為250(3～2 916)和7.05%(0.039%～76.3%)。ddPCR檢測T790M突變陽性率為65.2%，顯著高于ARMS-PCR(P<0.05)。兩種方法檢測均為陽性者(ddPCR+ARMS+)32例，均為陰性者(ddPCR-ARMS-)40例，檢測結果一致率為62.6%(表2)。

表2 ARMS-PCR和ddPCR檢測115例NSCLC患者T790M突變結果

ddPCR+ARMS-標本43例，平均陽性微滴數和平均突變豐度分別為11和0.35%，均顯著低于ddPCR+ARMS+樣本(632.3，17.7%)(圖1)。對于突變豐度<1%的樣本，ARMS-PCR的敏感性僅為7.0%(3/43)，隨著突變豐度的增加，ARMS-PCR敏感性也隨之升高，說明ddPCR對于突變豐度低的標本具有更高的敏感性。

圖1 ddPCR+ARMS-樣本與ddPCR+ARMS+樣本檢測結果對比

2.3 樣本類型與T790M突變檢出率

ARMS-PCR檢測基因組DNA(來源于組織及胸水脫落細胞標本)和cfDNA(來源于外周血)T790M突變的陽性率分別為27.9%(19/68)和27.7%(13/47)。ddPCR檢測基因組DNA和cfDNA樣本T790M突變陽性率分別為55.9%(38/68)和78.7%(37/47)(表3)。ddPCR檢測為T790M突變陽性組中，基因組DNA樣本的平均陽性微滴數顯著高于cfDNA樣本(327vs169,P=0.046)，基因組DNA樣本的平均突變豐度也顯著高于cfDNA樣本(10.0%vs3.94%,P=0.003)(圖2)。由此可見，組織樣本突變豐度通常高于cfDNA樣本，臨床應優選組織樣本送檢。

圖2 基因組DNA樣本與cfDNA樣本檢測結果對比

表3 ARMS-PCR和ddPCR檢測不同樣本類型中T790M突變陽性率

3 討 論

近年來，針對EGFR突變NSCLC患者的靶向治療在臨床應用越來越廣泛和深入，T790M突變的臨床檢測需求也愈發明確。EGFR基因T790M突變導致第790位的蘇氨酸被蛋氨酸所取代，從而增強了ATP與EGFR-TKI結合域的親和力，導致EGFR-TKI不能有效阻斷信號通路而產生耐藥[13]。原發性T790M突變是EGFR-TKI療效的不良預測因子。研究發現，靶向治療前就同時檢出EGFR敏感性突變(如19del、L858R等)和T790M突變的患者，其無進展生存期低于僅發生EGFR敏感性突變的患者[14]。據報道，發生EGFR-TKI耐藥的晚期NSCLC患者，在明顯臨床證據提示疾病進展前的344天即可在外周血中檢出T790M突變的存在[15]。由此可見，在EGFR-TKI治療前、治療過程中應盡早地采用靈敏準確的方法檢測出T790M突變，可為EGFR-TKI種類的選擇和用藥方案的及時調整提供關鍵依據。

T790M突變的檢測方法不斷推陳出新，目前臨床上應用廣泛、價格低廉、方便快捷且靈敏度高的方法主要是ARMS-PCR和ddPCR兩種。本研究采用這兩種方法同時檢測115例NSCLC患者不同類型標本，比較兩種方法在T790M突變檢測方面的性能。結果顯示ddPCR較ARMS-PCR具有更高的敏感性，與既往文獻報導一致[16-18]。對于突變豐度>1%的樣本，ARMS-PCR和ddPCR表現出較高的一致性，但ddPCR在突變豐度<1%的外周血cfDNA樣本檢測中顯示出較大的優勢。而且，ddPCR能夠進行絕對定量，可為動態監測提供重要信息。樣本類型方面，組織或胸水脫落細胞包含的突變豐度高，但臨床實際中大多耐藥的患者已處于疾病晚期，二次活檢難度大，這種情況下應首選ddPCR檢測外周血cfDNA樣本，協助治療方案的選擇及預后判斷。

本研究同時使用ddPCR和ARMS-PCR對115例NSCLC患者進行檢測分析，樣本例數較大，納入樣本類型較全，全面對比了兩種檢測技術的敏感性、一致性以及在不同樣本類型中的陽性率，為臨床在檢測技術的選擇和樣本類型選擇方面提供了有價值的依據。但本研究為單中心回顧性研究，相匹配的患者血漿和腫瘤組織納入例數較少，難以進一步對同一患者來源的基因組DNA和cfDNA樣本結果一致性進行比較。

根據現有數據可知，ddPCR較ARMS-PCR具有更高的靈敏度，而且可提供突變豐度數據，在監測NSCLC患者EGFR-TKIs耐藥后T790M基因狀態變化方面具有更大的優勢，可為臨床靶向治療方案的選擇及調整供重要依據。

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