貓瘟熱病毒血凝抑制與血清中和抗體滴度關系研究

張 峻，肖春燕

（1.上海應用技術大學，上海 201418；2.成都信息工程大學物流學院，四川 成都 610103）

貓泛白細胞減少癥病毒（FPV，同貓瘟熱病毒）是一種單鏈 DNA病毒，是原細小病毒屬中食肉動物原細小病毒中的一種[1]。FPV同犬細小病毒（CPV）和水貂腸炎病毒均能夠導致家貓及野貓因急性腸胃炎和骨髓抑制等急性致死癥狀而死亡[2]。FPV可通過貓口腔和鼻腔侵入動物體內，對咽喉淋巴等組織造成感染，并通過血液循環系統致病動物全身[3]，因此血液中是否存在抗FPV抗體對預防及治療貓瘟熱十分重要。對家貓和野貓接種抗FPV疫苗是預防此疾病的重要手段。目前我國針對貓泛白細胞減少癥使用的疫苗多為碩騰三聯滅活疫苗（妙三多）和英特威三聯微毒疫苗[4]，接種這類疫苗后可能存在因疫苗自身因素、動物應激程度、母源抗體以及人為因素等無法形成抗體導致疫苗接種失敗[5]。因此，我們可以把測量血液抗FPV抗體滴度作為評估FPV感染免疫狀態的方法。血清中和（SN）實驗是目前血清學實驗中標準較高的一種，因其測得的SN抗體與動物機體感染保護能力密切相關，所以SN特異性病毒血清學實驗與其他檢測方法相比準確性最高[6]。因SN實驗成本過高且耗時過長，目前臨床上多利用血凝抑制（HI）實驗作為SN實驗的簡單替代方法，但是FPV抗體檢測的準確性低于SN實驗[7]。根據目前的研究發現，針對抗CPV抗體的HI和SN實驗在抗體滴度數據上相關度較低，但是針對抗FPV抗體的HI和SN實驗在抗體滴度比較上的研究較少，因此本實驗的主要目的是利用HI實驗結果作為FPV保護性抗體效價指標的準確性研究。本實驗的結論是通過HI實驗提取抗FPV抗體，將結果呈現陰性或弱陽性滴度的貓血清進行SN實驗，對2種實驗中呈現的抗體滴度結果進行比較研究后得出。

1 實驗材料

實驗樣本是2020年3月至2021年3月通過成都市和重慶市兩地寵物醫院收集到的806只已接種過FPV疫苗（未區分疫苗品牌）、臨床表現健康的家貓血清樣本。

病料是2020年3月從重慶市寵物醫院1只因感染貓瘟熱而出現腹瀉癥狀的家貓體內分離并培養出的FPV-Som4菌株。

2 實驗方法

2.1 血凝抑制實驗準備

利用HI實驗傳統方法稍做修改，進行抗FPV抗體滴度檢測。將25 mL經過豬紅細胞和高嶺土處理的熱滅活血清樣本，在96孔V型底微孔板中用磷酸鹽緩沖鹽水溶液(PBSS，pH 6.7)以1∶10的比例進行2倍稀釋，同時加入等體積FPV-Som4菌株。1 h后將濃度為0.5%的豬紅細胞添加到每個板孔中。再經過4℃12 h培養后，得出的抗體滴度即為血凝抑制完全后的最高血清稀釋度。

2.2 實驗過程

因FPV感染的培養細胞病變作用弱，難以進行SN實驗中抗體效價終值的判斷，所以還需要對HI實驗中各孔感染情況進行檢測。在整個實驗中，抗體效價是利用96孔組織培養微孔板進行測定分析的。利用一式4份50 μL體積的樣本血清從1∶10的比例稀釋2倍后，每孔加入100 μL半數組織培養感染劑量（TCID50）的FPV-Som4菌株。再進行1 h培養后將貓腎細胞加入病毒-血清培養液中繼續培養5 d，將獲得的培養液加入與培養液等體積、濃度為0.5%的豬紅細胞96孔V型底微孔板中，即可測定抗體效價。本次實驗測定的抗體效價為血凝抑制達50%時的最高血清稀釋度。

3 實驗結果與分析

3.1 HI實驗及SN實驗結果數據

利用HI實驗測定這806份血清樣本時發現，其中有67份（8.3%）樣本未檢測出FPV抗體（測試滴度＜1∶10），15 份樣本 HI抗體滴度為 1∶10，26 份樣本HI抗體滴度為 1∶20，53 份樣本 HI抗體滴度為 1∶40。針對實驗結果為陰性及弱陽性的樣本再次進行SN實驗，獲得的實驗數據如表1所示。其中，在HI實驗結果為陰性的67份樣本中有43份 （64.2%）樣本利用SN 實驗測定存在 FPV 抗體（測試滴度＞1∶10）。HI實驗測得的抗體呈陰性的樣本利用SN實驗進行再測試后，滴度范圍在＜1∶10至 1∶160之間，計算出的幾何平均數（GM）為 1∶20.38。

表1 HI檢測為陰性及弱陽性樣本SN再測試數據表

將 HI實驗測得的抗體滴度分別為 1∶10、1∶20及1∶40的所有樣本重新進行SN實驗后，測得的SN抗體滴度數據分布如圖1所示。其中，SN實驗測得的抗體滴度范圍在 1∶13 至 1∶200 時幾何平均數為 1∶67.51，抗體滴度范圍在 1∶80至 1∶650時幾何平均數為 1∶273.89，抗體滴度范圍在1∶120至1∶1500時幾何平均數為1∶547.51。以往的文獻顯示，利用HI實驗測定抗體滴度的保護閾值設定為1∶20是最高的，但是本次研究發現，實驗存在 52.2%（35/67）HI抗體滴度＜1∶10 的樣本及20%（3/15）HI抗體滴度為1∶10的樣本低于該閾值。

圖1 抗體弱陽性檢測對比圖

3.2 數據處理及分析

根據HI實驗抗體滴度數據算出各滴度組中SN實驗抗體滴度倒數對數值的平均值及標準差分別為1.886±0.774（＜1∶10）、1.836±0.314（1∶10）、1.874±0.180（1∶20）和 1.709±0.159（1∶40），利用平均值及標準差計算出的變異系數 （CV） 值分別為 41.04%（＜1∶10）、17.10%（1∶10）、9.61%（1∶20）和 9.30%（1∶40）。將 SN 實驗測得的滴度平均值作為X值，對應的HI實驗滴度組作為Y值利用皮爾森相關系數公式:

經公式計算r結果為0.747。將整體計算結果結合對應變異系數，各HI實驗測得滴度組分布情況直觀展現如圖2所示。因皮爾森相關系數值為0.747，比較接近1，說明2種實驗在抗體效價之間的相關性較高。但是根據變異系數顯示，當利用HI實驗測得的抗體滴度＜1∶10時，樣本存在一定程度變異（41.04%）。在后續實驗中對近期接種過疫苗的動物個體進行性別、品種和年齡抽樣時，并未發現與實驗總體分析結果有差異。

圖2 滴度組相關性示意圖

在以往針對CPV的研究中發現，其中和表位及血凝素位在VP2抗原上處于不同位置[8]，說明利用HI實驗并不一定能夠有效反映出中和能力。目前的研究并未發現FPV也有這樣的特性，但是因FPV與CPV屬于相同種屬的病毒，其可能具有相似的形態學特征。針對本次研究，在進行HI實驗及SN實驗時，抗體滴度的皮爾森相關系數值為0.747，證明兩者在抗體效價間的相關性較高，但是利用HI實驗測得滴度＜1∶10時SN實驗抗體滴度的變異系數較高，顯示兩者間存在一定的不一致。另外，在64.2%的樣本中利用HI實驗測試結果為陰性的樣本在經過SN實驗后檢測到存在FPV抗體，證明利用HI實驗測試抗體敏感度較SN實驗低，這與之前的相關研究一致，可能是因實驗本身性質及FPV病毒性特性導致的。就目前的文獻來看，少有研究FPV不同疫苗間的反應率。但是根據部分文獻顯示，存在部分動物個體在16周后定時接種3次及以上疫苗后利用HI實驗檢測并未發現FPV抗體，可能因動物個體或部分品牌疫苗效能不足導致抗體經HI實驗測得結果有差異。因此，針對部分已完成FPV疫苗接種但利用HI實驗無法測得存在抗體的個體可利用SN實驗進行重新測定，以保證抗體檢測的準確性。

綜上所述，本研究的結論是利用SN實驗測得的對FPV疫苗效果，尤其是在HI測定抗體滴度結果為陰性及弱陽性貓中的準確性優于HI實驗測定。

4 結論與展望

根據實驗結果，建議用1∶20至1∶40的滴度作為FPV保護性HI抗體滴度閾值。但就目前現有文獻及相關研究而言，針對設定這類閾值的參考基礎尚不明確，因此本實驗對FPV保護性HI滴度閾值的測量是基于將SN抗體滴度閾值設定在1∶10至1∶32的實驗感染結果范圍內進行的。SN抗體滴度為1∶32是實驗中顯示SN抗體閾值中最高的，即在所有HI抗體滴度為1∶20或更高比例的貓個體中是最高的。因此，在將HI抗體效價作為指標評價FPV保護能力時，將閾值設定為1∶20可能是最為合適的。

在本次實驗過程中，為了避免因母源抗體對測試結果造成影響，在樣本選擇過程中我們均選擇了7月齡以上的貓，因此所有檢測到的抗FPV抗體均是主動免疫的產物。但是實驗結果顯示，利用HI方法進行測試無法檢測到抗體數量占比較高。因本實驗原理的局限性所致，利用HI測試可能無法檢測到此類病毒感染而產生的抗體，同時盡管兩種測試間的不一致可能僅是因HI測試的靈敏性低造成的，但是結果不能排除本實驗中存在一定的動物個體已經感染了FPV，在使用HI測試時需要考慮這種可能。

因本文的目的是為了比較HI與SN之間的差距，未對不同品牌FPV疫苗性能進行評估，因此在未來相關研究工作中可根據同一疫苗接種動物進行。同時因CPV與FPV病毒屬性的相似性，也可在未來對CPV進行HI準確性研究。