PI3K/Akt信號通路在鹿茸增強內皮祖細胞活性及其細胞遷移中的作用

韓 杰，李廷荃，李子娟，王雁彬，霍 凱

下肢動脈硬化閉塞癥(arteriosclerosis obliterans of the lower extremities，ASOLE)是臨床上常見的一種周圍血管疾病，由于動脈硬化造成內膜增厚、管腔狹窄閉塞，導致相應區域供血不足，甚至引起肢體末端壞疽，導致截肢[1-2]。前期研究表明，鹿茸能夠促進下肢動脈硬化閉塞大鼠血管新生、內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)增殖及促血管生成相關因子升高[3]，但具體機制尚未明確。磷脂酰肌醇3-羥基激酶(PI3K)是蛋白激酶B(Akt)的上游信號分子，可激活Akt來調節細胞內信號通路和細胞功能的變化，在血管新生中發揮著重要作用[4-5]。本實驗以下肢動脈硬化閉塞癥大鼠為模型，通過檢測CD133+細胞比例、血清血管內皮生長因子(VEGF)、基質細胞衍生因子(SDF)-1α含量以及腓腸肌內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、趨化因子受體4(CXCR4)陽性表達來研究鹿茸通過PI3K/Akt信號通路促進血管新生及細胞遷移的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠80只，2月齡，體質量250～300 g，由山西省中醫藥研究院提供，實驗動物質量合格證號：1103221911003889。

1.2 飼料制備 高脂飼料，含80.3%基礎飼料、15%豬油、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、4%膽固醇。

1.3 藥物與試劑 鹿茸采用馬鹿茸，購自北京同仁堂(集團)有限責任公司，用普通粉碎機制成粗粉，再用氣流超微粉碎機制成微粉(粒徑小于10 μm)，溫水調，攪拌均勻，即用即配。PI3K抑制劑LY294002購于美國Selleck公司中國分公司(美國輝瑞公司授權經銷商)，用二甲基亞砜(DMSO)配制母液(10 mg LY294002溶于6.507 5 mL DMSO中)于-20 ℃冰箱保存，每日配制當日所需工作液(10%母液+40%PEG300+5%Tween-80+45%氯化鈉溶液)，即用即配；維生素D3針劑(哈爾濱摩天農科獸藥有限責任公司，批號：20190318)；CD133抗體、CD133同型對照抗體(BD公司，批號：751261)；VEGF酶聯免疫吸附實驗(ELISA)測定試劑盒(Elabscience，貨號：E-EL-R2603c)、SDF-1α ELISA試劑盒(Elabscience，貨號：E-EL-R2495c)；CXCR4、eNOS抗體(Abcam公司)；PI3K、Akt抗體(Abcam公司)。

1.4 儀器 電子天平(Metter，瑞士)；移液器(Eppendorf，德國)；微量加樣吸頭(北京中衫金橋生物有限公司)；微型高速離心機(Froilabo，法國)；顯微鏡(Olympus公司，日本)；脫水機、包埋機、凍臺(武漢俊杰電子有限公司)；病理切片機(上海徠卡科技有限公司)；烤箱、微波爐、冰箱(美的電器制造有限責任公司)；流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)；全自動酶標儀(Thermo scientific)、Multiskan Mirco-plate reader(Thermo)、VE180 Mini-protean 3 Dodeca(Tanon)、VE186 TBC(Tanon)、PowerPac HC Power Supply(BioRad)、PH meter(Sartorius)、Shaker(Kylin-Bell)、Homogenizer(Fluko)。

1.5 方法

1.5.1 動物模型制備 采用隨機數字表法將大鼠分為8組：空白組、模型組、鹿茸低劑量組、鹿茸中劑量組、鹿茸高劑量組、LY294002+鹿茸低劑量組、LY294002+鹿茸中劑量組、LY294002+鹿茸高劑量組，每組10只，分組后將大鼠以10%水合氯醛溶液(3.5 mL/kg)腹腔麻醉，隨后取平臥位，固定于手術臺上，左側腹股溝備皮，碘伏消毒左側腹股溝區域后，于此處行一長約1.5 cm縱切口，暴露血管鞘，分離股動脈及其分支，齒鑷沿股動脈走形鉗夾約30 s，分別結扎并離斷左側股動脈的分支；用0號線縫合皮下組織及皮膚，背部皮下注射生理鹽水10 mL補液抗休克，觀察大鼠各項生命體征平穩后放回鼠籠；給予3×105U青霉素肌肉注射3 d，預防感染；高脂飼料喂養12周；予維生素D3(3×105U/kg)右下肢肌肉注射，每月1次。

1.5.2 給藥方法 鹿茸低劑量組、中劑量組、高劑量組灌胃給藥[0.143 g/(kg·d)、0.286 g/(kg·d)、0.572 g/(kg·d)]。LY294002組腹腔注射LY294002[1 mg/(kg·d)]；空白組、模型組給予等容量蒸餾水。LY294002+鹿茸低劑量組、LY294002+鹿茸中劑量組、LY294002+鹿茸高劑量組先行腹腔注射再灌胃。于造模完成第1天開始給藥，每日1次，連續28 d，28 d后處死。

1.5.3 標本采集及處理方法 將大鼠麻醉后，用小鑷子摘去1只眼球，收集外周血到EP管中；取大鼠術側下肢股骨，注射器抽吸磷酸緩沖鹽溶液(PBS)反復沖洗骨髓腔，濾網過濾骨髓沖洗液，離心，吹打制成均勻的骨髓懸液，收集到EP管中，-80 ℃凍存。

1.5.4 檢測指標

1.5.4.1 流式細胞術檢測外周血、骨髓中CD133+細胞比例 每只大鼠各設置5個管，2個單染測定管及同型對照管，另加1個三染測定管。于抗凝管中加紅細胞裂解液5 mL，37 ℃恒溫水溫箱中避光孵育10 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清，再次于抗凝管中加紅細胞裂解液5 mL，37 ℃恒溫水溫箱中避光孵育10 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加PBS緩沖液350 μL，每個樣品分裝到5個1.5 mL的離心管中，每管50 μL按CD133對照、CD133檢測、三色檢測順序標明各管，共5管。各管中加入對應的抗體，4 ℃避光孵育20～25 min，各管加1 mL PBS緩沖液洗滌1次，1 500 r/min離心5 min，棄上清。加PBS緩沖液定容至500 μL，將樣本按CD133對照、CD133檢測、三色檢測移至流式管中備用。將樣品重懸，按CD133對照、CD133檢測、三色檢測順序上機檢測，以488 nm氫離子激光激發，每次計數50 000，軟件分析各管雙陽性細胞所占比例。

1.5.4.2 ELISA法檢測外周血SDF-1α、VEGF水平 將試劑盒、標本預先在37 ℃中平衡至少30 min；確定檢測所需的已包被抗體的酶標板孔數目，并增加1孔作為四甲基聯苯胺(TMB)空白顯色孔；將2 000 pg/mL、1 000 pg/mL、500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5 pg/mL、31.2 pg/mL的標準品各0.1 mL依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液作為零孔；加已用樣品稀釋液稀釋的樣品100 μL，酶標板加上蓋，37 ℃反應90 min；自動洗板機吸去酶標板內的液體；將準備好的生物素抗大鼠相應抗體工作液按每孔0.1 mL依次加入，37 ℃反應60 min；用0.01 mol/L PBS洗滌3次；將準備好的ABC工作液按每孔0.1 mL依次加入，37 ℃反應30 min；PBS洗滌5次；按每孔90 μL依次加入已在37 ℃平衡30 min的TMB顯色液，37 ℃避光反應25 min；按每孔0.1 mL依次加入TMB終止液，此時藍色轉變為黃色；用酶標儀在450 nm測定吸光度(OD)值；以濃度作為橫坐標，OD值作為縱坐標，根據樣品的OD值在坐標上找出對應的濃度，用ELISA應用軟件計算及繪圖。

1.5.4.3 免疫熒光技術檢測腓腸肌中eNOS、CXCR4水平 涂片后用多聚甲醛進行固定10 min；用PBS微振蕩洗滌5 min(2次)。加0.4% Triton-X100破膜5～10 min，用PBS微振蕩洗滌3 min(3次)；用1%PBS封閉液室溫封閉30 min至1 h；用0.5% PBS稀釋一抗，比例為1∶100；4 ℃過夜；從冰箱拿出后37 ℃復溫45 min；或室溫2～3 h；或37 ℃1 h；孵育后用PBS微振蕩洗滌5 min(3次)；用0.5% PBS稀釋二抗，比例為1∶400；室溫30 min至1 h；孵育后用PBS微振蕩洗滌5 min(3次)；4，6二脒基2苯基吲哚(DAPI)原液為1 g/mL，稀釋濃度為1∶1 000，快速染色10 s，用蒸餾水沖洗；用防淬滅的封片劑封片，熒光顯微鏡高倍視野下觀察。

1.5.4.4 蛋白質印跡(Western Blot)法檢測PI3K、Akt蛋白表達 根據目的蛋白的分子量，配制10%分離膠，濃縮膠濃度為5%。待檢測蛋白樣品上樣量：每孔28 μg。電泳條件：濃縮膠恒壓90 V，約20 min；分離膠恒壓120 V，通過預染蛋白marker來確定電泳停止時間。濕轉法，轉膜條件300 mA恒流；0.45 μm孔徑聚偏氟乙烯(PVDF)膜，轉膜時間90 min。轉膜完成后應用麗春紅染色試劑對膜進行染色，觀察轉膜效果。封閉：將膜完全浸沒于5%牛血清白蛋白(BSA)-TBST中，水平搖床孵育1 h。一抗孵育：5% BSA-TBST稀釋一抗(稀釋比例1∶1 000)，4 ℃水平搖床孵育過夜。次日，洗膜：TBST洗3次，每次10 min。二抗孵育：5% BSA-TBST稀釋二抗，山羊抗兔、山羊抗鼠IgG(H+L)辣根過氧化物酶(HRP)1∶10 000，室溫孵育40 min。洗膜：TBST洗膜3次，每次10 min。電化學發光(ECL)液滴加到膜的蛋白面，反應3 min；膠片曝光：10 s至5 min(曝光時間隨不同光強度而調整)，顯影2 min，定影。圖片掃描后，使用軟件Gel Image ststem ver.4.00 (tanon，中國)對圖像進行灰度分析。

2 結 果

2.1 大鼠下肢動脈硬化閉塞癥模型建立情況 下肢動脈硬化閉塞癥大鼠造模成功，分離、結扎效果明顯，每組有1～2只死于術后感染。除空白組外，其余各組大鼠均有不同程度的下肢活動障礙，部分有下肢壞死。

2.2 各組給藥后外周血、骨髓中CD133+細胞比例比較 與空白組比較，模型組及給藥組CD133+細胞比例升高；與模型組比較，各給藥組CD133+細胞比例均降低(P<0.05)；其中，鹿茸高劑量組高于LY294002+鹿茸高劑量組，LY294002+鹿茸高劑量組高于鹿茸中劑量組，鹿茸中劑量組高于LY294002+鹿茸中劑量組，LY294002+鹿茸中劑量組高于鹿茸低劑量組，鹿茸低劑量組高于LY294002+鹿茸低劑量組，差異均有統計學意義(P<0.05)；骨髓與外周血中CD133+細胞比例趨勢基本相同。詳見表1。

表1 各組外周血、骨髓中CD133+細胞比例比較(±s)

2.3 各組外周血VEGF、SDF-1α水平比較 與空白組比較，模型組及給藥組VEGF、SDF-1α水平均降低，各給藥組VEGF、SDF-1α水平均高于模型組，其中，鹿茸高劑量組高于LY294002+鹿茸高劑量組，LY294002+鹿茸高劑量組高于鹿茸中劑量組，鹿茸中劑量組高于LY294002+鹿茸中劑量組，LY294002+鹿茸中劑量組高于鹿茸低劑量組，鹿茸低劑量組高于LY294002+鹿茸低劑量組，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組外周血VEGF、SDF-1α水平比較(±s) 單位：pg/mL

2.4 各組腓腸肌中eNOS、CXCR4陽性表達比例比較 模型組及給藥組eNOS、CXCR4陽性表達比例均明顯低于空白組(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組eNOS、CXCR4陽性表達比例明顯升高(P<0.05)；各給藥組eNOS、CXCR4陽性表達比例為鹿茸高劑量組>LY294002+鹿茸高劑量組>鹿茸中劑量組>LY294002+鹿茸中劑量組>鹿茸低劑量組>LY294002+鹿茸低劑量組，組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖1。

與空白組比較，① P<0.05；與模型組比較，② P<0.05；③ 與鹿茸高劑量組比較，P<0.05；④ 與LY294002+鹿茸高劑量組比較，P<0.05；⑤ 與鹿茸中劑量組比較，P<0.05；⑥ 與LY294002+鹿茸中劑量組比較，P<0.05；⑦ 與鹿茸低劑量組比較，P<0.05。

2.5 Western Blotting檢測PI3K、Akt蛋白表達水平 與模型組比較，各給藥組PI3K、Akt蛋白表達水平均升高(P<0.05)；與各抑制劑組比較，各對應給藥組PI3K、Akt蛋白表達水平均升高(P<0.05)。詳見圖2、圖3。提示鹿茸對下肢動脈硬化閉塞大鼠的內皮祖細胞動員及歸巢促進血管新生的作用可能與其上調PI3K/Akt信號通路活性有關。

圖2 各組大鼠腓腸肌中PI3K、Akt蛋白表達電泳圖(1為鹿茸低劑量組；2為鹿茸中劑量組；3為LY294002+鹿茸高劑量組；4為模型組；5為空白組；6為LY294002+鹿茸低劑量組；7為LY294002+鹿茸中劑量組；8為鹿茸高劑量組)

＊ 與模型組比較，P<0.05；# 與鹿茸高劑量組比較，P<0.05；△ 與鹿茸中劑量組比較，P<0.05；▲ 與鹿茸低劑量組比較，P<0.05。

3 討 論

周圍血管疾病是繼心腦血管疾病后又一嚴重危害健康的疾病，輕則導致病人肢體功能障礙，嚴重則導致殘疾甚至危及生命。下肢動脈硬化閉塞癥是動脈粥樣硬化的進一步發展，當眾多致病因素導致的血管內皮受損程度超過機體修復時，血管內皮細胞會減少，功能受損，使其外周血中EPCs功能明顯下降[6]。EPCs是內皮細胞的前體內皮，主要來源于骨髓，具有較強的增殖能力，不僅可以從骨髓動員、遷移進入外周血，參與損傷血管內皮的修復，而且可以生成新的血管，在治療心腦血管疾病、外周缺血性疾病、腫瘤血管病等中扮演著越來越重要的角色[7]。EPCs早期主要有其免疫表型：早期表型主要有CD34、CD133和VEGF受體(R)2，晚期表型主要有CD34+及VEGF+[8]。其中，CD133的表達是EPCs的一個標志，也是區分EPCs和成熟內皮細胞的主要指標。

鹿茸具有補腎、填精、益髓的功效[9]，鹿茸主要成分鹿茸多肽對表皮細胞及成纖維細胞有顯著的促進增殖作用，可以加速創面愈合，促進血管內皮細胞的增殖分化及遷移，促進病變部位的血管生成[10]。

PI3K/Akt信號通路廣泛存在于各種正常細胞和腫瘤細胞中，是一條對細胞的生長、增殖、遷移及分化起重要調節作用的信號轉導通路[11]。SDF-1α又稱趨化因子CXCL12，是趨化因子家族重要成員之一，具有不可代替的生物學活性。SDF-1的唯一受體CXCR4在造血干細胞-祖細胞表面及EPCs表面高度表達。多項研究顯示，SDF-1α/CXCR4軸對多種細胞的遷移起重要調節作用，內皮細胞膜表面CXCR4的功能性表達促使SDF-1α生成增加，后者可高效誘導內皮細胞遷移和胞漿內Ca2+濃度升高[12]。CXCL12和VEGF之間也存在反饋軸，起著共同調節EPCs增殖、遷移和生成血管的作用。SDF-1可促使多種細胞合成VEGF，而VEGF表達的增加又可上調SDF-1受體的表達。VEGF能靶向性作用于EPCs，促使其強烈增殖、分化，誘發體內生成血管[13]。

PI3K/Akt在VEGF等因子作用下，阻止內皮細胞凋亡，磷酸化后可激活eNOS，促進NO合成，促進新生血管形成[14]。eNOS不僅表達于成熟的內皮細胞，同時也表達于EPCs，生成NO，調節EPCs并發揮其生物學功能。另外，eNOS也作為EPCs的一個生物標志，用于EPCs的鑒定[15]。PI3K/Akt的激活及其下游eNOS的磷酸化是EPCs合成NO的重要途徑，NO可促進EPCs的增殖、遷移及血管新生。本實驗發現PI3K特異性抑制劑LY29400能夠進一步抑制EPCs Akt磷酸化和eNOS的表達，同時幾乎可以阻斷SDF-1α誘導的EPCs遷移。

本研究結果表明，鹿茸能夠促進EPCs活性，增強EPCs的增殖、遷移、黏附及成小管功能；而PI3K抑制劑能阻斷鹿茸含藥血清對EPCs功能的促進作用，減少EPCs分泌NO，降低EPCs表達eNOS的水平，表明鹿茸調控EPCs是通過PI3K/Akt信號通路。