脈絡(luò)寧注射液通過Akt信號(hào)通路降低Hcy誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究

何秀芳，譚誠成，李圣永

隨著人們生活水平的提高，心血管疾病的發(fā)病率呈不斷升高趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類的健康[1]。大部分研究認(rèn)為，各種心血管疾病危險(xiǎn)因素都源自血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生損傷后，可引起血管壁的生理病理變化，最終導(dǎo)致一系列的心血管疾病[2-3]。因此，有效保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)于心腦血管疾病的防治具有重要意義。高同型半胱氨酸(Hcy)是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，Hcy可通過誘導(dǎo)血管氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而引起內(nèi)皮發(fā)生功能障礙[4]。研究表明，Hcy可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[5]。脈絡(luò)寧注射液是中西醫(yī)結(jié)合方法研究出的中藥復(fù)方注射液，由牛膝、金銀花、石斛、玄參組成，具有補(bǔ)益肝腎、活血化瘀等功效。有研究顯示，脈絡(luò)寧對(duì)缺氧誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷有保護(hù)作用[6]。脈絡(luò)寧注射液可降低高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[7]。但脈絡(luò)寧注射液對(duì)Hcy誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是否具有保護(hù)作用尚未明確。因此，本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304為研究對(duì)象，旨在探討脈絡(luò)寧注射液對(duì)Hcy誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激及蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；脈絡(luò)寧注射液購自金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠；四甲基偶氮唑鹽(MTT)溶液、二甲基亞砜(DMSO)均購自美國Sigma公司；細(xì)胞凋亡試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒及微量丙二醛(MDA)試劑盒均購自江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司；2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)熒光探針購自江蘇碧云天公司；Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、淋巴瘤B細(xì)胞-2(Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體購自美國Abcam公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304購自美國ATCC。細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，加入適量的RPMI 1640培養(yǎng)液，并將密度調(diào)整為2×104個(gè)/mL，接種于培養(yǎng)瓶中，于5 %體積分?jǐn)?shù)二氧化碳(CO2)、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后細(xì)胞貼壁生長，48 h后細(xì)胞單層鋪滿瓶底呈現(xiàn)融合生長，按照常規(guī)方法傳代。選擇生長狀態(tài)良好的同批細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞增殖活力檢測(cè) 取生長狀態(tài)良好的ECV304細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，并以2×104個(gè)/mL密度接種于96孔板，每孔150 μL。細(xì)胞完全貼壁后，更換為無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，換為含10 mmol/L Hcy的培養(yǎng)液，設(shè)置僅加入正常培養(yǎng)液的細(xì)胞為對(duì)照組，作用24 h后，加入終濃度為2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L的脈絡(luò)寧，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)48 h。每孔中加入5 mg/mL的MTT溶液15 μL，常規(guī)孵育4 h，按照每孔150 μL加DMSO，輕搖混勻。酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長處各孔的光密度值(OD)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將ECV304細(xì)胞分為對(duì)照組、Hcy組(10 mmol/L Hcy處理細(xì)胞24 h)、Hcy+脈絡(luò)寧組(10 mmol/L Hcy處理細(xì)胞24 h，加20 mg/L脈絡(luò)寧處理細(xì)胞48 h)。接種ECV304細(xì)胞于96孔板，于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)12 h，按照上述分組處理細(xì)胞。處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，離心，棄掉上清，加入200 μL的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。然后分別加入5 μL異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白(Annexin Ⅴ-FITC)和5 μL碘化丙啶(PI)，室溫避光反應(yīng)10～15 min。1 h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)檢測(cè) 收集按照上述分組處理后的細(xì)胞，離心，棄掉上清液，加入1 mL培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，離心，棄掉上清液。37 ℃避光條件加入500 μL終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA，反應(yīng)20 min，離心。無血清培養(yǎng)液洗滌2次，再加入500 μL培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞內(nèi)SOD活性及LDH、MDA水平檢測(cè) 收集按照上述分組處理后的細(xì)胞，參照SOD試劑盒、LDH試劑盒及MDA試劑盒說明分別檢測(cè)SOD活性及LDH、MDA水平。

1.7 Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)檢測(cè) 收集按照上述分組處理后的細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解液裂解反應(yīng)30 min，離心，上清即為提取蛋白。采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品與上樣緩沖液等量混勻，100 ℃變性5 min。每孔加40 μg蛋白，經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜及封閉后，加經(jīng)TBST稀釋的Akt、p-Akt、Bcl-2和Bax一抗(1∶500)，室溫?fù)u床1 h，4 ℃孵育過夜，洗膜。加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶1 000)，室溫孵育3 h，洗膜。電化學(xué)發(fā)光(ECL)液滴加到膜上，曝光。Image J軟件分析灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 脈絡(luò)寧對(duì)Hcy誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞活力的影響 MTT法檢測(cè)2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L脈絡(luò)寧對(duì)Hcy誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Hcy組細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)；與Hcy組比較，5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L脈絡(luò)寧組細(xì)胞活力明顯升高(P<0.05)，而2.5 mg/L脈絡(luò)寧組細(xì)胞活力與Hcy組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。選擇20 mg/L脈絡(luò)寧為研究濃度。詳見表1。

表1 不同濃度脈絡(luò)寧對(duì)Hcy誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞活力的影響(±s)

2.2 脈絡(luò)寧對(duì)Hcy誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞凋亡的影響 Hcy組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，Hcy+脈絡(luò)寧組細(xì)胞凋亡率明顯低于Hcy組(P<0.05)。詳見圖1、表2。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組ECV304細(xì)胞凋亡率

表2 脈絡(luò)寧對(duì)Hcy誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞凋亡率的影響(±s) 單位：%

2.3 脈絡(luò)寧對(duì)Hcy誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞ROS水平的影響 Hcy組ROS水平明顯高于對(duì)照組，而Hcy+脈絡(luò)寧組ROS水平明顯低于Hcy組(P<0.05)。詳見表3。

表3 脈絡(luò)寧對(duì)Hcy誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞ROS水平的影響(±s)

2.4 脈絡(luò)寧對(duì)Hcy誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞SOD活性及LDH、MDA水平的影響 與對(duì)照組比較，Hcy組SOD活性明顯降低(P<0.05)，LDH和MDA水平明顯升高(P<0.05)；與Hcy組比較，Hcy+脈絡(luò)寧組SOD活性明顯升高(P<0.05)，LDH和MDA水平明顯降低(P<0.05)。詳見表4。

表4 脈絡(luò)寧對(duì)Hcy誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞SOD活性及LDH、MDA水平的影響(±s)

2.5 脈絡(luò)寧對(duì)Hcy誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞Akt、p-Akt、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，Hcy組p-Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與Hcy組比較，Hcy+脈絡(luò)寧組p-Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。詳見圖2、表5。

圖2 Hcy誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞Akt、p-Akt、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)電泳圖

表5 脈絡(luò)寧對(duì)Hcy誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞Akt、p-Akt、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響(±s)

3 討 論

多數(shù)研究者認(rèn)為，血管內(nèi)皮細(xì)胞是人體最大的內(nèi)分泌腺，能夠分泌出多種與機(jī)體有關(guān)的活性物質(zhì)，炎癥反應(yīng)、血壓穩(wěn)定、脂質(zhì)代謝等都與這些活性物質(zhì)的分泌有關(guān)[8-9]。Hcy是蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物，大量研究表明，Hcy可引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、損傷，Yang等[10]研究顯示，Hcy可通過抑制線粒體活性損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞；Liu等[11]研究顯示，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)通過調(diào)節(jié)線粒體依賴性凋亡信號(hào)和磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)/Akt/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)信號(hào)通路降低Hcy誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。本研究檢測(cè)不同濃度的脈絡(luò)寧注射液對(duì)Hcy誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞增殖活力的影響，發(fā)現(xiàn)5～20 mg/L脈絡(luò)寧注射液均可促進(jìn)ECV304細(xì)胞增殖，因此，選擇20 mg/L脈絡(luò)寧注射液為研究濃度，且20 mg/L脈絡(luò)寧注射液可明顯降低Hcy誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞凋亡。

一般情況下，ROS不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS或抗氧化酶出現(xiàn)異常時(shí)，可引起細(xì)胞凋亡或壞死。有研究顯示，ROS可引起血管損傷[12-14]。降低ROS水平可明顯減弱血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，趙艷紅等[15]研究顯示，Hcy可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，增強(qiáng)一氧化氮(NO)活性，而熱休克蛋白27(HSP27)可降低Hcy引起的細(xì)胞損傷；陳洪娜等[16]研究顯示，Hcy可引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，ROS水平升高，核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)表達(dá)升高，而Diplacone可對(duì)Hcy引起的細(xì)胞損傷起保護(hù)作用。SOD在生物界廣泛分布，是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，對(duì)機(jī)體和細(xì)胞ROS氧化損傷起保護(hù)作用[17]。MDA是氧自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)得到的毒性終產(chǎn)物，可間接反映機(jī)體對(duì)氧自由基的清除能力。LDH是機(jī)體能量代謝中的一種重要酶，其水平也可反映機(jī)體對(duì)氧自由基的清除能力[18]。本研究結(jié)果顯示，Hcy可引起ROS、MDA和LDH水平升高，SOD活性降低，而脈絡(luò)寧注射液可減弱Hcy對(duì)ROS、MDA和LDH水平及SOD活性的影響。提示脈絡(luò)寧注射液可能通過抑制氧化應(yīng)激而減弱Hcy引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號(hào)途徑，參與細(xì)胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激等過程[19]。Akt是PI3K下游的主要效應(yīng)物，Akt活化可通過調(diào)節(jié)下游雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、Bcl-2、Bax等基因，經(jīng)過多種途徑影響細(xì)胞生長[20]。有研究顯示，神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子-1(Netrin-1)可通過PI3K/Akt/eNOS減弱高糖引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血管生成障礙[21]；miR-126可通過靶向PI3K/Akt信號(hào)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[22]。Bcl-2和Bax為Bcl-2家族成員，發(fā)揮抑凋亡和促凋亡的作用，有研究顯示，抑制Bax表達(dá)及促進(jìn)Bcl-2表達(dá)可降低血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[23-24]。本研究結(jié)果顯示，Hcy可抑制p-Akt及Bcl-2表達(dá)，增強(qiáng)Bax表達(dá)，而脈絡(luò)寧注射液可減弱Hcy對(duì)p-Akt、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響。提示脈絡(luò)寧注射液可能通過Akt信號(hào)途徑對(duì)Hcy誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷起保護(hù)作用。

綜上所述，脈絡(luò)寧注射液對(duì)Hcy誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，機(jī)制可能與降低氧化損傷及激活A(yù)kt信號(hào)途徑有關(guān)。本研究為脈絡(luò)寧注射液在心血管疾病中的研究提供了理論依據(jù)，但還需更多的研究證實(shí)。