恒清Ⅳ號方對帕金森病大鼠模型睡眠障礙的作用及其機制研究

陳慧澤，孟勝喜，霍清萍，王 兵，李文濤，潘衛東，張云云

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一種進行性神經退行性疾病，影響多巴胺能神經傳遞，導致運動遲緩、強直和靜止性震顫[1-2]。2016年全球PD患病人數為606.3萬人[3]，2017年患病人數增至853.0萬人[4-5]。在我國60歲以上人群中，PD發病率為1%～2%[6]。PD病程進展過程中病人均有不同程度的運動功能異常或障礙，且伴隨其他非運動障礙系統癥狀，在后者中通常以睡眠障礙(sleep disorders)為主。PD病人合并睡眠障礙癥狀的非運動障礙病癥在PD長期病程發展中，執行功能受損尤為常見，這是認知功能損害的主要癥狀[7]。中醫藥因其多層次、多靶點、多途徑且副作用小等作用特點和優勢在PD的防治中越來越受到國內外學者的關注和重視。中藥復方恒清Ⅳ號方是本課題組通過長期臨床觀察總結出的防治PD療效確切的中藥復方。本實驗旨在探討中藥復方恒清Ⅳ號方對PD模型大鼠睡眠障礙的作用及其機制，為中藥復方恒清Ⅳ號方防治PD提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 無特定病原體(SPF)級雄性Wistar大鼠60只，體質量170～200 g，購于上海靈暢生物科技有限公司，動物生產許可證號：SCXK (滬)2018-003，大鼠飼養于上海吉凱基因化學技術有限公司動物房，自由飲水和進食，溫度(22±2)℃，相對濕度為(60±5)%，自動光/暗控制(每12 h交替)。

6-羥基多巴(6-hydroxydopamine，6-OHDA，lot：H122，Sigma-Aldrich公司，美國)、阿撲嗎啡(apomorphine，lot：M5432，Sigma-Aldrich公司，美國)，抗壞血酸(lot：54-82-3，上海時代生物技術有限公司)，腦立體定位儀(深圳瑞沃德公司)，腦電信號采集分析系統(成都泰盟公司)，高效液相色譜儀(島津公司，日本)，振動切片機(萊卡公司，德國)。

恒清Ⅳ號方組成：熟地黃20 g，淫羊藿20 g，黃芪15 g，肉蓯蓉10 g，龜板15 g，地龍10 g，天麻15 g，丹參10 g，川芎10 g，當歸10 g，白芍10 g。由上海市第六人民醫院中藥房提供。按處方比例稱取以上藥材，加10倍量水浸泡0.5 h，隨后煎煮3次，每次40 min，過濾，合并以上3次濾液，37 ℃水浴加熱濃縮，根據臨床實際用藥情況對藥液進行濃縮處理，并以中質量濃度匹配臨床的實際用藥濃度。中質量濃度濃縮至0.535 g/mL，置4 ℃冰箱貯存備用。

1.2 PD模型大鼠的制備和動物分組 采用10%水合氯醛對Wistar大鼠進行腹腔注射麻醉，固定于腦立體定位儀上。首先，剝離大鼠的腦膜，以大鼠立體定位圖譜為參照確定前腦內側束坐標，然后用微量注射器注射4 μL濃度為4 g/L的6-OHDA(0.02%抗壞血酸的生理鹽水溶液作為溶劑)。待大鼠清醒后腹腔注射青霉素，連續腹腔注射3 d。造模4 周后，腹腔注射1.0 mg/kg的阿撲嗎啡誘發旋轉實驗。PD模型大鼠造模成功的判定標準：3次誘導旋轉圈數均為30 min>210 r。

將40只造模成功的大鼠按照隨機數字表法分為模型組、恒清Ⅳ號方低劑量(low dose，LD)組、恒清Ⅳ號方中劑量(middle dose，MD)組和恒清Ⅳ號方高劑量(high dose，HD)組，每組10只。另取10只未造模的正常大鼠作為正常組。LD組、MD組和HD 組大鼠每日以相應劑量的恒清Ⅳ號方溶液灌胃。依據人和動物體表面積折算系數換算[8]，LD組、MD組及HD組分別為10 mg/kg、20 mg/kg及40 mg/kg，以磷酸緩沖鹽溶液(PBS)配制，共灌胃4 周。正常組及模型組大鼠均以等量生理鹽水灌胃，共灌胃4 周。

1.3 各組大鼠睡眠時間檢測 將大鼠固定于腦立體定位儀上。把3個腦電電極全部植入顱骨內，把2個肌電電極分別植入兩側頸部深肌層。1周后記錄大鼠的腦電圖(EEG)及肌電圖(EMG)[9-10]。各組均記錄72 h時大鼠的EEG和EMG，并以10 s為一個時間段分析及鑒別，記錄每組大鼠總睡眠時間(total sleep time，TST)、覺醒時間(awaken time，AT)、快波睡眠時間(fast wave sleep time，FWST)和慢波睡眠時間(slow wave sleep time，SWST)。

1.4 高效液相色譜法(HPLC)分析各組大鼠紋狀體中多巴胺(DA)及5-羥色胺(5-HT)含量 大鼠采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，斷頭后取腦，放入人工腦脊液中，從大鼠腦片中分離出紋狀體的組織樣品，將1 mg以上樣品加入0.04 mol/L高氯酸100 μL，進行超聲粉碎30 s，然后以4 ℃、14 000 r/min離心30 min，取上清液，分別取20 μL進行HPLC，采用Breeze 2軟件計算單位體積樣品中DA及5-HT含量。

2 結 果

2.1 各組大鼠TST、AT、FWST和SWST比較 與正常組比較，模型組大鼠TST明顯縮短，AT明顯延長，SWST及FWST明顯縮短(P<0.05)；與模型組比較，LD 組、MD組和HD組大鼠TST延長，AT縮短，SWST、FWST延長(P<0.05)；與LD組比較，MD組、HD組大鼠TST延長，AT縮短，SWST、FWST延長(P<0.05)。與MD組比較，HD組大鼠TST延長，AT縮短，SWST、FWST延長(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠TST、AT、FWST和SWST比較(±s) 單位：min

2.2 各組大鼠紋狀體中DA、5-HT水平比較 與正常組比較，模型組大鼠紋狀體DA、5-HT水平均明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，LD組、MD組和HD組大鼠紋狀體DA、5-HT水平均升高(P<0.05)；與LD組比較，MD組、HD組大鼠紋狀體DA、5-HT水平均升高(P<0.05)；與MD組比較，HD組大鼠紋狀體DA、5-HT水平均升高(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠紋狀體中DA、5-HT水平比較(±s) 單位：ng/mg

3 討 論

PD是一種進行性加重的神經退行性疾病，以進行性運動和非運動功能障礙為主要特征，是第二大神經系統退行性疾病。目前尚缺乏有效根治手段。PD在中醫學中屬于“顫證”的范疇。中醫藥在防治PD方面發揮著越來越重要的作用。

5-HT和DA是在機體睡眠-覺醒過程中發揮重要作用的神經遞質[11-12]。5-HT為抑制性神經遞質，可調節睡眠-覺醒周期，促進慢波睡眠產生并縮短入眠期和淺睡期，起到鎮靜催眠的作用[13]。DA是單胺類神經遞質，PD病人DA的減少直接影響生物鐘的基因環路，引起晝夜節律紊亂[14-16]。

恒清Ⅳ號方是本課題組基于中醫基礎理論，通過長期臨床觀察總結出的防治PD療效確切的中藥復方，其組成如下：熟地黃20 g，淫羊藿20 g，黃芪15 g，肉蓯蓉10 g，龜板15 g，地龍10 g，天麻15 g，丹參10 g，川芎10 g，當歸10 g，白芍10 g。全方共奏補益肝腎、滋陰補血、活血祛瘀之功。

現代藥理研究已經證實，熟地黃可能通過升高抑制性氨基酸相關基因的表達而緩解左旋多巴誘導異動癥的癥狀[17]；熟地黃的主要成分熟地黃多糖能夠抑制小鼠的自發活動，縮短閾下劑量戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠潛伏期，延長睡眠時間[18]。黃芪的主要成分黃芪甲苷可增加PD小鼠自發活動次數，且呈一定的劑量依賴性[19]。肉蓯蓉可以改善PD模型大鼠的行為障礙，其對多巴胺神經細胞的保護作用可能是通過影響磷脂酸肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信號通路，上調Bcl-2表達，下調Bax表達，升高Bcl-2/Bax值，進而抑制神經細胞的凋亡實現的[20]。龜甲水煎液對PD模型大鼠有治療作用，能減輕黑質路易小體的表達，減少腦組織內原有多巴胺神經元的缺失，量效關系明顯[21]。地龍的乙酸乙酯、氯仿和水提部位是其鎮靜、催眠、抗驚厥作用的主要活性部位[22]。川芎的主要成分川芎嗪(ligustrazine)可以明顯改善1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)誘導的大鼠運動障礙并可顯著防止MPTP誘導的多巴胺能神經元損傷[23]。丹參可以改善腦微循環，提高血流中氧的含量，促使受傷的腦細胞得以修復，糾正紊亂的大腦功能，保護腦神經的正常傳遞和傳導，解除病人由于失眠而產生的各種不良癥狀如頭痛、焦慮等，使病人能進入正常的睡眠[24]。當歸揮發油可有效改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經功能缺損，降低腦梗死體積比、腦血管通透性和腦含水量，降低血清一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)含量，增強超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性。提示當歸揮發油對腦缺血再灌注損傷有顯著保護作用，其作用機制可能與提高腦組織抗氧化能力有關[25]。芍藥的主要成分芍藥苷可明顯延長戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠時間，具有明顯的催眠作用[26]。

本研究結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠TST明顯縮短，AT明顯延長，SWST及FWST明顯縮短(P<0.05)；與模型組比較，LD組、MD組和HD 組大鼠TST延長，AT縮短，SWST、FWST延長(P<0.05)；與LD組比較，MD 組、HD組大鼠TST延長，AT縮短，SWST、FWST延長(P<0.05)；與MD組比較，HD組大鼠TST延長，AT縮短，SWST、FWST延長(P<0.05)。表明恒清Ⅳ號方可有效改善PD模型大鼠的睡眠障礙，增加TST，減少AT，且恒清Ⅳ號方的療效與劑量呈正相關。與正常組比較，模型組大鼠紋狀體DA、5-HT水平均明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，LD組、MD組和HD組大鼠紋狀體DA、5-HT水平升高(P<0.05)；與LD 組比較，MD組、HD組大鼠紋狀體DA、5-HT水平升高(P<0.05)；與MD組比較，HD組大鼠紋狀體DA、5-HT水平升高(P<0.05)。表明PD大鼠模型的紋狀體DA、5-HT水平均與恒清Ⅳ號方的劑量呈正相關。

因此，恒清Ⅳ號方可以改善PD大鼠模型的睡眠障礙，且量效關系呈正相關，其可能通過提高紋狀體中DA、5-HT含量而發揮作用。