冠心病病人外周血sCD14、TLR4表達與冠狀動脈粥樣硬化斑塊穩定性的關系

李海龍，林英子

冠狀動脈硬化性心臟病又稱冠心病，主要是由冠狀動脈狹窄造成機體供血不足引起的心肌功能障礙[1]。冠心病病人冠狀動脈血管易形成粥樣硬化，出現冠狀動脈粥樣硬化斑塊，但冠狀動脈中斑塊易發生破裂、出血。冠狀動脈粥樣硬化斑塊是否穩定及其形態與冠狀動脈疾病發生有密不可分的關系[2]。有文獻報道，炎癥反應在冠狀動脈粥樣硬化斑塊不穩定中起著重要作用[3]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是一類介導炎癥反應的受體家族。有研究顯示，TLR4可激活核因子κB(NF-κB)，導致大量炎性因子[如腫瘤壞死因子α(TNF-α)]產生[4]。白細胞分化抗原14(CD14)是機體炎癥反應顯著的標志物。血清中CD14以可溶性CD14(soluble CD14，sCD14)形式存在。已有研究報道sCD14可在動脈粥樣硬化發病機制中發揮作用[5]。本研究將觀察不同類型冠心病病人外周血TLR4和sCD14表達水平，并分析TLR4和sCD14與冠狀動脈粥樣硬化斑塊穩定性的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年10月—2020年2月我院心血管內科收治的冠心病病人146例(冠心病組)，男102例，女44例；年齡50～80(63.25±8.72)歲；疾病類型：穩定型心絞痛(SAP)38例，不穩定型心絞痛(UAP)55例，急性心肌梗死(AMI)53例。冠心病病人納入標準：①符合世界衛生組織關于冠心病的診斷標準[6]，經冠狀動脈造影(coronary angiography，CAG)檢查，至少有1支冠狀動脈狹窄程度≥50%；②靜息型心絞痛持續時間≥20 min；③心絞痛發作時心電圖出現ST段改變，發作暫停后，ST段迅速恢復正常；④臨床資料完整。排除標準：①嚴重肝、腎、心功能不全者；②伴有惡性腫瘤者；③伴有全身性免疫疾病者；④近2個月內有手術史；⑤合并先天性心臟病、風濕性心臟病、肺源性心臟病；⑥凝血功能障礙者。依據參考文獻[7]，根據CT冠狀動脈成像將冠狀動脈粥樣硬化斑塊分為軟斑塊(-40～50 Hu)、混合型斑塊(各種成分均有)、硬斑塊(>120 Hu)，由2名有經驗的放射科醫師共同判讀。選取同期體檢健康者146名為對照組，其中，男95名，女51名；年齡45～80(63.68±9.21)歲。本研究受試者均知情同意，并簽署臨床研究協議書，且經醫學倫理委員會批準同意，符合《世界醫學大會赫爾辛基宣言》。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集 冠心病病人入院時采集靜脈血5～6 mL，對照組在體檢當天采集靜脈血5～6 mL，一份裝于采血管中，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，留上清，凍存于-80 ℃冰箱中，待測；另一份裝于含乙二胺四乙酸(EDTA)采血管中，直接凍存于-80 ℃冰箱中，待測。

1.2.2 sCD14水平檢測 采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清中sCD14水平，人sCD14 ELISA試劑盒(貨號：110-01)購自南京賽泓瑞生物科技有限公司。

1.2.3 外周血TLR4檢測 取出凍存血液樣品，解凍，設置實驗管和同型對照管。向試管中加入等體積的紅細胞裂解液，3 000 r/min離心5 min，棄上清。向試管中加入等體積的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)稀釋試管中成分，離心5 min，向實驗管中加入5 μL藻紅蛋白(PE)鼠抗人TLR4(CD284)和APC鼠抗人CD14抗體，向同型對照管加入鼠免疫球蛋白G1和APC鼠抗人CD14抗體。混勻，靜置15 min，離心，留細胞沉淀，加入固定劑溶液1 mL，混勻，用流式細胞儀ProCOUNT軟件檢測TLR4陽性率。

1.3 臨床資料收集 收集所有研究對象體質指數(BMI)、既往病史、尿常規(尿素氮、尿肌酐)及生化檢測結果。采用日立7600-20生化全自動分析儀檢測研究對象血清中三酰甘油(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density liptein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein，LDL-C)、總膽固醇(total cholesterol，TC)水平。

1.4 Gensini評分評定 使用Gensini評分評估病人冠狀動脈病變程度。Gensini評分的評分標準依據參考文獻[8]，分值越高，冠狀動脈狹窄程度越嚴重。

2 結 果

2.1 各組臨床資料比較 各組性別、年齡、BMI、糖尿病、高血壓、尿素氮、肌酐、TG、TC、HDL-C、LDL-C比較差異均無統計學意義(P>0.05)；與SAP組比較，AMI組、UAP組Gensini評分升高(P<0.05)；與UAP組相比，AMI組Gensini評分升高(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組臨床資料比較

2.2 各組外周血sCD14、TLR4表達水平比較 與對照組比較，SAP組、AMI組、UAP組sCD14、TLR4表達水平升高(P<0.05)；與SAP組比較，AMI組、UAP組sCD14、TLR4表達水平升高(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組外周血sCD14、TLR4表達水平比較(±s)

2.3 不同成分斑塊組外周血sCD14、TLR4表達水平比較 軟斑塊組52例，混合型斑塊組48例，硬斑塊組46例。與硬斑塊組比較，軟斑塊組、混合型斑塊組sCD14、TLR4表達水平升高(P<0.05)；與混合型斑塊組比較，軟斑塊組sCD14、TLR4表達水平升高(P<0.05)。詳見表3。

表3 不同成分斑塊組外周血sCD14、TLR4表達水平比較(±s)

2.4 冠心病病人外周血sCD14、TLR4表達水平與Gensini評分的相關性 Pearson相關分析結果顯示，sCD14、TLR4表達水平均與Gensini評分呈正相關(P<0.05)。詳見表4。

表4 冠心病病人外周血sCD14、TLR4表達水平與Gensini評分的相關性

2.5 Logistic回歸分析冠心病病人冠狀動脈粥樣硬化斑塊不穩定的影響因素 以冠心病病人冠狀動脈粥樣硬化斑塊是否穩定為因變量，以入院Gensini評分、sCD14、TLR4為自變量，Logistic回歸分析結果顯示，高水平TLR4、高水平sCD14、高Gensini評分是冠心病病人冠狀動脈粥樣硬化斑塊不穩定的危險因素(P<0.05)。詳見表5。

表5 Logistic回歸分析冠心病病人冠狀動脈粥樣硬化斑塊不穩定的影響因素

3 討 論

炎癥反應被認為是動脈粥樣硬化發生的關鍵機制。冠心病病人一旦發生動脈粥樣硬化斑塊破裂，會加重病情，而斑塊破裂是在斑塊不穩定性時發生的[9]。斑塊成分復雜，硬斑塊屬于穩定斑塊，軟斑塊屬于不穩定斑塊，混合型斑塊介于穩定與不穩定斑塊之間。斑塊穩定性一定程度上可影響冠心病的病情發展[10]，及早預測斑塊穩定性對預估冠心病病人病情具有重大意義。TLR4基因位于9號染色體長臂(9q33.1)上，編碼的蛋白在病原體識別和天然免疫激活中起著基礎性作用。研究證實TLR4與配體結合后形成二聚體，進而啟動下游炎癥反應；另外，在免疫細胞合成TLR4后，通過信號轉導途徑激活NF-κB，誘導細胞產生促炎因子(如TNF-α)[11]。徐凱等[12]研究發現，急性冠脈綜合征病人外周血單個核細胞TLR4表達水平明顯高于正常體檢者，且AMI病人外周血TLR4表達水平高于SAP病人，3支冠狀動脈病變病人明顯高于單支、雙支冠狀動脈病變病人。本研究發現AMI組和UAP組外周血TLR4表達水平明顯高于SAP組和對照組，SAP組外周血TLR4表達水平明顯高于對照組，提示TLR4可能參與冠心病的發生過程。本研究中AMI組和UAP組外周血TLR4表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，與徐凱等[12]研究結果不同，可能是因為本研究樣本量較小，研究結果存在偏倚。本研究發現軟斑塊組TLR4表達水平高于硬斑塊組、混合型斑塊組，混合型斑塊組TLR4表達水平高于硬斑塊組，提示TLR4可能與冠狀動脈粥樣硬化斑塊穩定性密切相關，推測TLR4可能促進斑塊內炎癥反應，從而促進斑塊不穩定、破裂。相關性分析結果顯示，TLR4與Gensini評分呈正相關，提示TLR4水平變化可能與冠狀動脈病變程度相關。

CD14可分為兩大類，一類是膜結合型(mCD14)，位于單核、巨噬等細胞的細胞膜上；一類是sCD14，存在于機體外周血中。CD14受體位于多形核細胞，如單核、巨噬等細胞的細胞膜上。已經證明CD14在炎癥中起作用，其與受體相互作用后，促進促炎細胞因子的表達，并促進全身性炎癥反應，可能是監測炎癥的有價值參數[13]。Carron等[14]發現慢性腎臟疾病可進展為終末期腎病，此過程與持續的低度炎癥及腸道細菌有關，炎癥及腸道細菌會使腸道上皮屏障破損，進而細菌產物脂多糖(LPS)可攜帶CD14從腸腔轉移到外周血中，使病人外周血中sCD14濃度升高。王磊等[15]發現血清中sCD14水平在由炎癥反應引起的心房結構重構的心房顫動病人中明顯升高。本研究發現AMI組、UAP組sCD14表達水平高于SAP組和對照組，SAP組sCD14、TLR4表達水平高于對照組，提示sCD14可能參與冠心病的發生及發展。本研究發現軟斑塊組sCD14表達水平高于硬斑塊組、混合型斑塊組，混合型斑塊組sCD14表達水平高于硬斑塊組，提示sCD14可能與冠狀動脈粥樣硬化斑塊形態有關，推測sCD14可能通過促進機體炎癥反應影響斑塊穩定性。相關性分析發現sCD14與Gensini評分呈正相關，提示sCD14水平變化可能影響冠狀動脈病變程度。Logistic回歸分析顯示，高水平TLR4、高水平sCD14、高Gensini評分是冠心病病人冠狀動脈粥樣硬化斑塊不穩定的危險因素，提示通過檢測TLR4、sCD14表達水平有助于判斷冠狀動脈粥樣硬化斑塊是否穩定。

綜上所述，冠心病病人外周血TLR4表達水平及血清sCD14水平明顯上調，二者在冠狀動脈粥樣硬化斑塊形成及斑塊不穩定性中可能發揮重要作用。