miR-381-3p通過靶向ERK1/2/ETS1信號通路影響MC3T3-E1細胞成骨分化

陳錦成 朱國濤 秦曉飛 陳彥丞 羅駿 余博飛 吳宜璟 徐杰*

1.福建中醫藥大學中醫骨傷及運動康復教育部重點實驗室，福建 福州 350122

2.福建省立醫院骨二科，福建醫科大學，福建 福州350001

課題組前期利用Illuminanc高通量測序技術在肌少-骨質疏松癥[1]患者和骨質疏松癥患者的肌肉組織中檢測到了存在差異性表達的miRNA，其中肌少-骨質疏松癥組中miR-381-3p呈10.57倍的上調表達，且經實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證[2]，表明miR-381-3p可能參與肌少癥患者容易發生骨量丟失的病理過程[3]。通過利用TargetScan7.2軟件[4]對miR-381-3p 可能調控的靶點進行預測，綜合預測結果發現其靶基因可能為ETS1。

MicroRNA是一類廣泛存在于真核生物當中，長度在21～23個核苷酸的單鏈小分子RNA[5]。成熟的miRNA 通過形成沉默復合體，再通過完全或不完全配對與特定靶基因的3’UTR結合，起到抑制mRNA翻譯或是直接降解mRNA的作用，從而影響了靶基因的表達水平[6]。據報道miRNA在維持骨骼發育和新陳代謝方面起著至關重要的作用[7]。Elias等[8]發現ETS1屬于調控骨骼生成的轉錄因子；ETS1可存在于胞核內，激活的ERK1/2二聚物可以直接刺激修飾ETS1，同時直接抑制修飾成脂分化特異性指標PPARγ[9]；此外，ETS1可通過與許多骨基質蛋白(ALP、Runx2、collagen I)基因DNA上特殊的調節區相結合，來激活并調節這些基因的表達。Fan等[10]研究發現ETS1對骨組織的發育和成骨細胞的分化與成熟起重要的調控作用。唐乖等[11]通過miRNA 靶基因預測工具對hsa-miR-381-3p進行生物信息學分析后發現，miR-381-3p的靶基因集合顯著富集于MAPK、Wnt、P53 等信號通路中，這三者均是調控成骨分化的重要通路[12-13]，而ETS1屬于MAPK/ERK1/2信號通路下游重要的轉錄因子。綜上，本課題擬研究miR-381-3p是否通過調控ERK1/2信號通路而抑制ETS1活性，最終影響MC3T3-E1細胞的成骨分化水平。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1主要實驗儀器設備：主要實驗儀器設備見表1。

表1 主要實驗儀器設備Table 1 Main experimental equipment

1.1.2主要實驗試劑：主要實驗試劑見表2。

表2 主要實驗試劑Table 2 Main experimental compounds

1.1.3實驗細胞株：在中國科學院細胞庫購買小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14(MC3T3-E1 subclone14)細胞株 (批號：GNM15)。

1.2 實驗方法

1.2.1構建miR-381-3p過表達和低表達細胞模型及實驗分組：根據漢恒慢病毒說明書進行轉染，轉染72 h后換上2 μg/mL濃度的嘌呤霉素的新鮮培養基，篩選出穩轉株。采用qRT-PCR檢測轉染效率。細胞實驗分為NC mimic miR-381-3p組、mimic miR-381-3p組、NC inhibitor miR-381-3p組和inhibitor miR-381-3p組，隨后4組均進行成骨誘導分化干預并檢測相關實驗指標。

1.2.2各組細胞中ALP的活性測定：用成骨誘導分化的培養液 (50 μg/mL抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10 nmol/L地塞米松) 連續誘導干預MC3T3-E1細胞7 d，每72 h換液1次，收集各組細胞干預后的培養液，然后2 000 r/min，離心8 min取上清液進行測定；向96孔板內加50 μL基質液、50 μL緩沖液和30 μL樣品，充分混勻37 ℃孵育15 min；添加150 μL顯色劑，輕輕振搖孔板混勻，酶標儀測定波長520 nm各孔的吸光度OD值；得到各組ALP活性原始實驗數據后根據說明書中酶活性計算公式操作并統計分析實驗數據。

1.2.3各組細胞茜素紅染色(ARS)檢測：各組MC3T3-E1細胞血清饑餓24 h，加入成骨誘導分化培養液繼續培養2周后，將各組細胞6孔板中的誘導分化培養液吸取干凈，用2 mL的1×PBS清洗2次；每個培養孔中加2 mL的4%中性甲醛溶液，室溫固定15 min后；中性甲醛溶液去除，用2 mL的1×PBS溶液清洗2次；每個培養孔中沿邊加2 mL茜素紅染液室溫避光染色15 min后；茜素紅染液去除干凈，再用2 mL的1×PBS緩慢沖洗3次減少染色背景干預；顯微鏡下觀察各組細胞成骨分化ARS染色情況并拍照記錄。

1.2.4實時熒光定量PCR測定各組細胞目的基因mRNA的表達水平：采用Trizol法提取各組細胞總RNA，利用超微量分光光度計測定RNA的濃度和純度質檢；各組定量后根據Takara反轉錄試劑盒使用說明書操作，將mRNA反轉錄為cDNA模板，反應體系20 μL。ALP、Runx2、ETS1、PPARγ、miR-381-3p、內參基因GAPDH和U6的引物序列及反應條件見表3。按照下列條件進行qRT-PCR反應：①預變性條件 95 ℃，30 s 1個循環；②PCR反應程序設置 95 ℃，5 s ；60 ℃ 30 s ，40個循環；③溶解曲線程序95 ℃，15 s ；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。軟件導出原始數據，以GAPDH作為內參，每組復孔3個，域值循環數(CT)值取均數。本實驗運用2-ΔΔCt算法對各組樣本目標基因表達水平進行相對定量分析，依據此數據統計分析與繪制柱狀圖。

表3 引物序列及反應條件Table 3 Primer sequences and reaction condition

1.2.5各組細胞中ALP、collagen Ⅰ、Runx2、ETS1、PPARγ、P-ERK1/2蛋白表達的檢測MC3T3-E1細胞穩轉株按分組條件培養14 d后，用4 ℃預冷2 mL的PBS液清洗2次，加入RIPA裂解液裂解細胞，離心，收集細胞上清液以獲得總蛋白，利用BCA蛋白定量法測定各組蛋白濃度，取5×蛋白上樣緩沖液與樣品渦旋混勻后金屬浴(99 ℃)煮沸10 min將蛋白變性。每個泳道20 μg蛋白樣品進行上樣，10 %聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉到聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫搖床封閉1 h，加入稀釋好的一抗，在4 ℃凍庫的搖床上孵育過夜，1×TBST清洗3次，每次5 min，加入HRP二抗后室溫搖床結合1 h，1×TBST清洗3次，每次5 min；加入超敏ECL化學發光試劑并用凝膠成像系統顯影，條帶用Image Lab 5.2軟件分析，目標蛋白灰度值與內參GAPDH灰度值之比為校正后蛋白灰度值，并數據統計分析與繪制成柱狀圖。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 MC3T3-E1細胞慢病毒轉染miR-381-3p熒光表達情況

MC3T3-E1細胞轉染帶綠色熒光蛋白(GFP)報告基因的病毒并篩選成穩轉株后可在熒光顯微鏡觀測到GFP表達效率，圖1為4組MC3T3-E1細胞在顯微鏡明場和熒光顯微鏡下拍攝結果，可見4組細胞GFP熒光表達均較強，轉染效率較高。

2.2 MC3T3-E1細胞中miR-381-3p轉染效率qRT-PCR檢測

分別在4組MC3T3-E1細胞中感染對應的病毒，經過嘌呤霉素篩選后構建成穩轉株，采用qRT-PCR檢測各組miR-381-3p的表達水平；NC mimic miR-381-3p組與mimic miR-381-3p組比較，差異倍數高達104.66倍(P<0.05)；NC inhibitor miR-381-3p組和inhibitor miR-381-3p組相比，差異倍數為0.74倍(P<0.05)，證明miR-381-3p表達水平被抑制；4組中miR-381-3p轉染效率經qRT-PCR驗證達到預期結果(圖2)，細胞實驗模型構建成功。

2.3 茜素紅染色(ARS)

各組MC3T3-E1細胞成骨誘導分化培養14 d后，NC mimic miR-381-3p組和NC inhibitor miR-381-3p組經ARS僅見少許散在的橘紅色鈣化結節 (圖3A和3C)，mimic miR-381-3p組經ARS未見形成具有代表性的橘紅色的鈣化結節 (圖3B)；而inhibitor miR-381-3p組經ARS細胞視野可見大片散在或連成一片分布于細胞表面的橘紅色經典鈣結節(圖3 D)。4組細胞茜素紅染色結果采用Image J軟件進行定量分析并運用GraphPad Prism8.4.2軟件進行統計分析(圖4)。

2.4 堿性磷酸酶(ALP)活性測定MC3T3-E1細胞的成骨分化能力

誘導成骨分化干預7 d，與mimic miR-381-3p組相比，NC mimic miR-381-3p組可一定程度上調細胞ALP的活性(P<0.05)；與NC inhibitor miR-381-3p組對比，inhibitor miR-381-3p組顯著上調細胞ALP的活性(P<0.05)，見圖5。

2.5 各組細胞中ALP、Runx2、ETS1和PPARγ mRNA表達的比較

與mimic miR-381-3p組比較，NC mimic miR-381-3p組可上調ALP、Runx2、ETS1 mRNA表達水平，其中PPARγ mRNA的表達水平則被下調(P<0.05)；與NC inhibitor miR-381-3p組對比，inhibitor miR-381-3p組可顯著上調ALP、Runx2和ETS1 mRNA表達水平，而PPARγ mRNA的表達水平則被下調(圖6)，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.6 各組細胞中ALP、collagen Ⅰ、Runx2、ETS1、PPARγ和P-ERK1/2蛋白表達比較

與mimic miR-381-3p組比較，NC mimic miR-381-3p組可上調ALP、Runx2、collagen Ⅰ、ETS1和P-ERK1/2的蛋白表達水平，其中PPARγ的蛋白表達水平則被下調(P<0.05)；與NC inhibitor miR-381-3p組對比，inhibitor miR-381-3p組可上調ALP、Runx2、collagen Ⅰ、ETS1和P-ERK1/2的蛋白表達水平，而PPARγ的蛋白表達水平則被顯著下調(P<0.05)(圖7)。當使用MAPK信號通路的抑制劑PD98059后，與inhibitor+PD98059組和PD98059組對比，inhibitor組可顯著上調ALP、Runx2、collagen Ⅰ、ETS1和P-ERK1/2的蛋白表達水平，其中PPARγ的蛋白表達水平顯著下調(P<0.05)(圖8)。

3 討論

MC3T3-E1細胞具備定向成骨分化特性，是近年來體外研究成骨細胞分化實驗的較為成熟的細胞模型[14]。在本研究中運用慢病毒轉染技術[15]，構建miR-381-3p過表達與低表達細胞模型，并且在qRT-PCR與蛋白實驗中證實miR-381-3p與EKR1/2/ETS1信號通路密切相關；當miR-381-3p過表達時EKR1/2/ETS1信號因子在MC3T3-E1細胞成骨分化中受到一定程度的抑制，同時成脂分化特異性指標PPARγ蛋白呈上調表達。miR-381-3p過表達通過下調生長與分化的MAPK/ERK信號通路中的兩個重要靶基因EKR1/2/與ETS1表達，抑制了MC3T3-E1細胞的成骨分化；此外，miR-381-3p與PPARγ的特異性結合并激活其表達，一定程度影響了MC3T3-E1細胞的成骨分化能力。

Qi和Kim等[16-17]研究表明，MAPK/ERK通路的激活在許多細胞類型的成骨分化中起重要作用。本研究中當miR-381-3p低表達時，細胞中Runx2、ALP、ETS1 mRNA和蛋白表達被上調以及下調PPARγ mRNA和蛋白的表達，并可上調MC3T3-E1細胞的ALP活性和礦化水平[18]；當miR-381-3p過表達時，細胞中Runx2、ALP、collagen Ⅰ和ETS1及P-ERK1/2的蛋白表達均顯著降低，而PPARγ mRNA和蛋白表達水平則是升高的，并且下調了MC3T3-E1細胞的ALP活性和礦化水平。Runx2、ALP、collagen Ⅰ和ETS1及P-ERK1/2都是與MAPK/ERK信號通路密切相關的轉錄因子[19-20]；當用研究中使用MAPK信號通路抑制劑PD98059一定程度抑制P-ERK1/2表達后，下游相關的轉錄因子活化水平同樣受到抑制。由此，證明了EKR1/2/ETS1信號因子密切參與miR-381-3p調控MC3T3-E1細胞成骨分化的過程。綜上研究數據和結合梳理相關文獻表明miR-381-3p的過表達可一定程度的下調EKR1/2/ETS1信號因子的表達，從而抑制了MC3T3-E1細胞的成骨分化能力。

眾所周知，PPARγ作為MAPK/ERK1/2通路下游的重要轉錄因子，其激活后可促進脂肪細胞分化并抑制成骨細胞分化，在實驗中我們揭示了過表達的miR-381-3p通過與PPARγ轉錄因子的3′UTR結合一定程度上抑制了P-ERK1/2與ETS1的表達。

miRNA在成骨代謝過程中主要發揮序列特異性轉錄后的調控作用[21]，越來越多的研究表明miRNA參與各種細胞生理過程的調控，其中包括細胞增殖與分化及脂肪代謝等，還重點參與調控骨質疏松癥、肌少-骨質疏松癥等疾病的發生發展過程[22]。miRNA對成骨代謝調控機制較為復雜，信號通路作為調控骨代謝的重要途徑，研究不同信號通路共同作用參與調節成骨代謝意義重大。以往研究更多是從miRNA直接調控或間接調控Wn通路因子活性與促進成骨細胞分化等方面開展相關研究[23]。本研究首先從篩選出特異性miRNA，然后設計實驗基本闡明了miR-381-3p抑制MAPK/ERK1/2/ ETS1信號軸活性而下調成骨代謝水平的機制。本研究不僅豐富了miRNA調控信號通路影響成骨代謝內容，還為后續相關miRNA結合MAPK信號通路研究成骨代謝提供了新思路和理論依據。