麥角甾苷治療對去卵巢大鼠骨質疏松癥保護機制研究

王海生 馬濤 張敏 陶周善

1. 皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院手足踝外科，安徽 蕪湖 241000

2. 皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，安徽 蕪湖 241000

骨質疏松癥是一種嚴重威脅健康的全身性骨骼疾病，其特征是骨量減少和骨小梁結構破壞，是骨折的最重要危險因素之一[1]。隨著世界范圍內(nèi)老年人口的不斷增加，骨質疏松癥的出現(xiàn)越來越普遍，有研究預測50歲以上的女性和男性中有50%和20%的人會在今后的人生中經(jīng)歷一次或多次骨質疏松骨折，這也給骨質疏松的預防和治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)[2]。盡管目前用于治療骨質疏松癥的藥物確實療效顯著，但可能出現(xiàn)與這些藥物有關的各種不良反應使其推廣使用遠未達到理想[3]。麥角甾苷(MJZG)又稱馬鞭草苷、毛蕊花糖苷，是存在于包括馬鞭草屬、肉蓯蓉屬植物在內(nèi)的數(shù)十種藥用植物中具有代表性的苯乙醇苷成分之一。近年來的研究發(fā)現(xiàn)其有多種優(yōu)異的生物活性，包括抗氧化[4]、抗炎[5]、神經(jīng)保護和改善肌肉萎縮特性[6]，因此受到更多的關注。RANKL/TRAF6/NF-κB和PI3K/AKT信號通路在骨代謝中對破骨細胞活性調(diào)控可發(fā)揮重要作用[7]。有研究[8]還發(fā)現(xiàn)MJZG可以通過阻斷破骨細胞的激活來減少骨丟失。所有上述證據(jù)都與我們的假設一致，即MJZG可能具有骨保護和減少骨量丟失的作用，且可能和RANKL/TRAF6/NF-κB和PI3K/AKT信號通路有關。因此，本研究通過去卵巢模型旨在探討MJZG對絕經(jīng)后骨質疏松癥可能作用并探索對RANKL/TRAF6/NF-κB和PI3K/AKT信號通路影響。

1 材料和方法

1.1 動物分組和治療

由南京實驗動物中心提供的30只雌性SD 大鼠(12周齡)，初始體重為(206±21)g，被安置在標準無病原體的規(guī)范實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境中[溫度控制在(24.0±0.5) ℃，45 %～50%的濕度和12/12小時明暗照明循環(huán)]。允許所有大鼠自由獲得自來水和飲食。適應環(huán)境1周后，在無菌條件下通過腹腔內(nèi)注射7 %水合氯醛(100 mg/kg)麻醉大鼠。然后對大鼠打開腹腔進行不切除卵巢手術(假手術，Sham)，或進行雙側卵巢摘除術(去卵巢手術，OVX)；隨后大鼠分為3組：Sham組、OVX組和麥角甾苷治療組(MJZG)，每組10只大鼠。其中MJZG組每天給予100 mg/kg麥角甾苷(成都格利普生物科技有限公司提供，純度>98%)灌胃治療。所有大鼠均不間斷治療12周，并根據(jù)體重每周調(diào)整一次劑量，本實驗使用的劑量參考國外研究中100 mg/kg麥角甾苷可以取得較好的療效[9]，因此使用該劑量。在治療12周后，所有大鼠在過量麻醉下進行處死，收集血液以4 000 r/min離心15 min收集血清，解剖出雙側股骨并保存在-80 ℃冰箱備測。本研究得到醫(yī)院倫理委員會批準(LLSC-2020-082)。

1.2 生物力學測試

使用生物力學機(3220, Bose corporation, Endura TEC systems group, Minnetonka, MN, USA)通過三點彎曲測試測量大鼠股骨的生物力學特性，包括最大載荷和剛度。測量過程中需要用V型彎曲夾具固定股骨的遠端和近端，將完整的股骨水平放置，正面朝上，然后在間隔20 mm的兩個支架上以0.02 mm/s的恒定加載速度加載股骨，并在此過程中記錄載荷和位移曲線，直到股骨骨折。通過對荷載位移曲線的分析，得到最大荷載和最大剛度。

1.3 骨小梁微觀結構分析

右股骨干骺端的骨小梁微結構是通過使用微型計算機斷層掃描(Micro-CT)系統(tǒng)(Micro-CT；Y. Cheetah；YXLON International GmbH，德國)確定，在三個空間維度上的分辨率為8 μm。選擇遠離股骨遠端的感興趣區(qū)域，在生長板開始平掃至生長板材下方2 mm處。骨形態(tài)參數(shù)包括骨密度(BMD)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁體積分數(shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)(Tb.N)和骨小梁分離度(Tb.Sp)，通過使用ABA骨分析軟件分析感興趣區(qū)域來獲得。

1.4 生化參數(shù)分析

使用自動分析儀(Ciba-Corning 550 Diagnostics, Corp., Oberlin, OH, USA)檢測血清生化參數(shù)水平。血清DPD、TRACP-5b和骨鈣素均使用Elisa試劑盒(Mountain View, CA, USA)進行測量。

1.5 蛋白質印跡

股骨在液氮中裂解，隨后將裂解的骨組織使用含有0.5 mmol苯基甲基磺酰氟，蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液裂解。接下來，將裂解物離心，并通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，并轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在室溫下用5 %脫脂牛奶封閉60 min后，用TRAF6(1∶500)、RANKL(1∶500)、RANK(1∶500)、NF-κB(1∶500)、PI3K(1∶500)、AKT(1∶500)、NFAT2(1∶500)、IKKβ(1∶500)、c-Fos(1∶500)和GPADH(1∶1 000)抗體，然后用這些抗體使膜在4 ℃下培養(yǎng)過夜，然后與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶2 000)孵育；最后，通過圖像實驗室軟件檢測印跡。重復蛋白質印跡實驗3次，將GPADH用作內(nèi)部對照。

1.6 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均使用均數(shù)±標準差表示，所有分析均使用SPSS 19.0軟件進行。組間使用單因素方差分析(ANOVA)進行；P<0.05表明比較差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HE切片分析

大鼠股骨干骺端松質骨HE染色顯示，與Sham組相比，去卵巢后大鼠骨小梁數(shù)量出現(xiàn)明顯減少、間距顯著增加；大量部位被脂肪細胞所代替，而麥角甾苷治療后的大鼠則觀察骨小梁明顯增加，且脂肪細胞重新被骨小梁所代替 (圖1)。

2.2 生物力學檢測

卵巢切除術后12周，與Sham組相比，OVX組的最大負荷和剛度顯著降低(P<0.05)。與OVX組大鼠相比，MJZG給藥時，最大負荷和剛度水平顯著增加(P<0.05)。見圖2。

2.3 MJZG預防去卵巢大鼠的骨量丟失

本研究使用Micro-CT評估MJZG對OVX大鼠股骨干骺端骨小梁的微結構。如圖3所示，與Sham組相比，OVX組大鼠BMD、Tb.Th、BV/TV、Tb.N顯著降低，而Tb.Sp明顯升高(P<0.05)。然而，相比于OVX組，用MJZG治療的OVX大鼠劑量依賴性地增加了BMD、Tb.Th、BV/TV、Tb.N并顯著降低Tb.Sp(P<0.05)。

2.4 MJZG對骨代謝指標的影響

骨代謝指標堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素 (BGP)、抗酒石酸的酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)和脫氧吡啶啉(DPD)檢測結果如圖4所示，與Sham組相比，卵巢切除術可顯著升高BGP、ALP、TRACP-5b和DPD的水平(P<0.05)。值得注意的是，與OVX組相比，用MJZG治療后的OVX大鼠中BGP、ALP、TRACP-5b和DPD水平顯著降低(P<0.05)。

2.5 蛋白印記檢測結果

各組大鼠股骨干骺端骨組織TRAF6、RANKL、NF-κB、NFAT2、PI3K、AKT和c-Fos表達檢測如圖5所示，和OVX組比較，MJZG組的TRAF6、RANKL、NF-κB和NFAT2的蛋白水平表達下調(diào)(P<0.05)，而PI3K、AKT和c-Fos上調(diào)(P<0.05)。MJZG可以通過抑制RANKL/TRAF6/NF-κB和激活PI3K/AKT來防治OVX大鼠骨量丟失。

3 討論

本研究結果表明，麥角甾苷可以增加骨密度和生物力學性能，并改善大鼠股骨干骺端骨小梁的微結構，并最終防止卵巢切除術引起的骨質疏松大鼠的骨質流失。

BMD是診斷骨質疏松的主要標志之一[10]，Micro-CT檢測還用于提供小梁微體系結構的其他直接信息，以評估骨的脆性[11]。Micro-CT技術可以代替組織學染色，為股骨干骺端骨小梁微結構提供直觀和定量數(shù)據(jù)，并且通過Micro-CT三維重建提供的骨小梁3 D圖像更為直觀，可以觀察到骨小梁的結構，并定量數(shù)據(jù)包括BMD、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp和BV/TV。因此，從Micro-CT獲得的數(shù)據(jù)對于骨質疏松癥診斷和治療更具體和全面。在本研究中，麥角甾苷治療顯著改善了OVX大鼠的BMD，骨微觀參數(shù)也得到了明顯改善，包括Tb.N、Tb.Th和BV/TV；而Tb.Sp的明顯降低；此外，麥角甾苷治療還能顯著提高了包括最大負荷和剛度在內(nèi)的生物力學參數(shù)。

骨代謝指標是血液和/或尿液中在骨形成或骨吸收過程中釋放的生化標志物，可以及時準確地反映全身骨代謝。骨代謝指標的檢查并不昂貴且無創(chuàng)，并且骨代謝指標可以重復測量。治療后骨代謝指標的變化可能比通過雙能X射線吸收法測量的BMD的變化更有意義[12]。骨代謝指標對骨質疏松癥的治療可能顯示出巨大而快速的反應，這可能是最佳劑量和劑量頻率選擇[12]。在絕經(jīng)后骨質疏松癥的過程中，股骨骨密度的降低和股骨干骺端骨微結構的破壞總是伴隨著包括ALP、BGP、TRACP-5b和DPD在內(nèi)的骨重塑標志物的顯著變化[13]。TRACP-5b和DPD是骨吸收的典型標志物，而ALP和BGP是廣泛使用的骨形成指標[14]。麥角甾苷的治療可顯著降低OVX大鼠的ALP、BGP、TRACP-5b和DPD的水平，這表明麥角甾苷能顯著降低去卵巢大鼠提高的骨轉換速度。

骨骼的重建和重塑是一個復雜的生理過程，需要有破骨細胞的功能[15]。由于雌激素水平急劇下降，破骨細胞的活性和分化能力在絕經(jīng)后顯著增加[15]。RANKL及其受體RANK是破骨細胞祖細胞的兩個關鍵分化因子，能夠刺激破骨細胞分化，然后介導破骨細胞形成[16-17]。此外，RANKL與RANK的結合可激活多種下游信號通路，包括NF-κB和PI3K /AKT，以及一些轉錄因子，包括NFAT2和c-Fos[7]，從而刺激了破骨細胞的發(fā)展和破骨細胞生成。然而，除非募集了TNF-受體相關因子(TRAF)，并且下游信號級聯(lián)被轉導，否則RANK受體蛋白缺乏固有的酶活性，因此認為TRAF6是主要的銜接子分子，可能對破骨細胞的功能和分化有用[18]。因此，RANKL/TRAF6/NF-κB信號通路認為是解釋破骨細胞形成的重要機制。在本研究中，麥角甾苷降低了RANKL、TRAF6和NF-κB，導致PI3K/AKT被激活，最終，NFAT2的水平減少和c-Fos的表達增加。

綜上，麥角甾苷可能通過RANKL/TRAF6/NF-κB和PI3K/AKT信號通路介導對OVX大鼠骨量流失產(chǎn)生保護作用，但是本研究未進一步進行陽性對照實驗和通路抑制和激活來證實其潛在的機制，后期會通過激動劑和抑制劑研究觀察麥角甾苷對骨髓間充質干細胞增殖分化以及成骨和破骨細胞的影響。