類風濕關節炎與骨質疏松癥的生物信息學分析

蔡鑫 唐芳 馬武開 蔣總 金澤旭 樊梅

1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550002

2.貴州中醫藥大學第二附屬醫院，貴州 貴陽 550003

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性全身性自身免疫性疾病，其病理特征是滑膜的對稱性炎癥，尤其在手、足小關節部位。慢性滑膜炎癥引起RA患者關節壓痛和關節損傷，導致功能障礙、生活質量下降和預期壽命縮短[1]。RA臨床表現不局限于關節炎癥，大約40%的RA患者存在類風濕結節、血管炎、肺纖維化、心包炎等關節外表現[2]。RA的另一個重要特征是局部骨質丟失，也稱為關節周圍骨質減少，研究發現關節周圍骨量丟失是炎癥細胞因子如白細胞介素-6(IL-6)或腫瘤壞死因子(TNF)對關節周圍持續影響的結果，更常見于抗瓜氨酸蛋白抗體(ACPA)陽性的RA患者[3-4]。在RA臨床發作前數年，ACPA就已經存在，因此部分患者局部骨量丟失在RA的臨床前階段就已經出現[5]。

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種肌肉骨骼疾病，其特征是骨骼強度受損，導致骨折風險增加。RA患者脊柱和髖部的平均骨密度值降低，隨著疾病進展而繼發OP，同時由于長期接受糖皮質激素治療，療程超過6個月的RA患者中近30%將發展為OP[6]。與OP相關的脆性骨折，無論是椎體還是非椎體，都是RA患者的一種嚴重并發癥，與年齡和性別匹配的對照組相比，RA髖部和椎體骨折的發生率更高，并且隨著病程、活動減少和頻繁使用糖皮質激素而增加[7-8]。

RA與OP的關系尚不完全清楚，本研究通過檢索獲得RA與OP的共同基因，構建疾病共同基因的蛋白互作(PPI)網絡并篩選出關鍵靶點基因，對關鍵基因進行GO和KEGG富集分析，為闡述RA與OP的共同發病機制及今后治療藥物的研發提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 疾病靶點獲取

在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數據庫(https://omim.org/)、TTD數據庫(http://db.idrblab.net/ttd/)、DRUGBANK數據庫(https://go.drugbank.com/)、CTD數據庫(https://ctdbase.org/)和DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org/)中以“rheumatoid arthritis”和“osteoporosis”為關鍵詞分別進行檢索，獲得RA及OP的疾病基因。利用Venny2.1軟件對RA和OP疾病基因進行去重和取交集，得到RA與OP的共同靶點基因。

1.2 PPI網絡分析與關鍵靶基因篩選

將獲得的RA與OP共同靶點基因導入STRING在線數據庫(https://string-db.org/cgi/)構建PPI網絡，物種設置為“Homo sapiens”，使用Cytoscap3.7.2軟件繪制PPI可視化網絡圖，借助R軟件篩選出PPI網絡中的關鍵靶點基因。

1.3 基因富集分析

借助DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)對RA與OP的共同靶點基因進行GO功能和KEGG通路富集分析，并繪制富集結果氣泡圖，利用Cytoscape3.7.2軟件繪制疾病基因-信號通路相互作用關系圖。

2 結果

2.1 RA與OP基因收集結果

通過檢索相關數據庫獲得RA相關基因5 388個、OP相關基因4 587個，通過取交集后獲得1 899個RA與OP共同靶點基因。見圖1。

2.2 PPI網絡及關鍵靶點基因

通過STRING數據庫構建RA與OP共同靶點基因的PPI網絡，該網絡圖中包括1 773個節點和69 267條邊(有126個基因未產生相互作用)。見圖2。為確定RA與OP的關鍵靶點基因，利用R軟件篩選出PPI網絡中度值(Degree)前30位的節點，包括IL-6、TNF、胰島素(INS)、AKT絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、p53腫瘤蛋白(TP53)、血管內皮生長因子A(VEGFA)及表皮生長因子受體(EGFR)等。見圖3。

2.3 GO和KEGG富集分析

將RA與OP共同靶點基因導入DAVID數據庫進行GO功能和KEGG通路富集分析。GO功能主要富集在受體配體活性(receptor ligand activity)、細胞因子受體結合(cytokine receptor binding)、細胞因子活性(cytokine activity)、肽結合(peptide binding)、囊泡(vesicle lumen)、T細胞活化(T cell activation)、肽分泌的調節(regulation of peptide secretion)及調節造血功能(regulation of hemopoiesis)等方面。見圖4。KEGG通路包括PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、JAK-STAT信號通路(JAK-STAT signaling pathway)、破骨細胞分化(osteoclast differentiation)、細胞凋亡(apoptosis)、Th17細胞分化(Th17 cell differentiation)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)及Wnt信號通路(Wnt signaling pathway)等信號通路。見圖5。運用Cytoscape3.7.2軟件繪制RA與OP共同靶基因-信號通路相互作用圖，圖中紅色節點表示疾病基因、綠色節點表示富集的KEGG信號通路，節點間連線數量表示相互作用頻率，節點越大，富集的疾病靶點基因越多。見圖6。

3 討論

RA是一種自身免疫介導的慢性炎癥性關節疾病，活化的滑膜細胞和滑膜巨噬細胞產生多種炎癥介質引起關節破壞[9]。OP是RA的常見并發癥，骨質疏松性骨折進一步加重了RA患者精神、心理負擔，對生活質量造成嚴重影響，目前發現炎癥因子在RA繼發OP的病理機制中具有重要作用[10-11]。本研究應用生物信息學方法對RA與OP的共同疾病基因進行分析，篩選出兩者的共同關鍵靶點基因和主要涉及的信號通路，為闡明RA與OP之間的聯系及今后研究提供參考。

通過構建RA與OP共同靶基因的PPI網絡，篩選出IL-6、TNF、INS、AKT1、TP53、VEGFA、EGFR等關鍵蛋白。IL-6、TNF等促炎細胞因子在RA患者血清和關節滑液中表達明顯升高，對炎癥引起的骨質流失起著關鍵作用，能夠刺激成纖維樣滑膜細胞和成骨細胞分泌核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)來誘導破骨細胞成熟和活化，從而促進骨吸收并抑制成骨細胞功能。應用IL-6抑制劑能增加RA患者股骨骨密度[12]，對伴有骨量降低的活動性RA患者進行抗TNF-α治療，可以有效阻止腰椎和髖部骨密度繼續下降[13]。INS通過與成骨細胞表面的功能性胰島素受體結合，促進其增殖、分化，當體內INS缺乏或發生胰島素抵抗時，成骨細胞的成骨能力明顯下降[14]。AKT1與RA成纖維樣滑膜細胞凋亡有關[15]，敲減該基因可導致小鼠骨化能力下降[16]。TP53(又稱P53)基因突變引起RA滑膜細胞異常增殖，加重疾病進展[17]。P53在OP患者血清中表達上調，抑制P53能夠部分逆轉骨密度降低[18]。VEGFA是血管發育形成的關鍵因素，使用VEGFA拮抗劑可阻斷RA新生血管形成并抑制營養物質向炎癥部位傳輸[19]。與RA不同的是，VEGFA能增強骨血管生成，促進體外成骨細胞的存活、分化及礦化[20]，具有積極作用。EGFR可促進RA滑膜血管新生，EGFR抑制劑能夠減輕小鼠自身免疫性關節炎，減少滑膜和血管翳的形成[21]。而EGFR對于骨祖細胞的維持和新骨形成至關重要，敲減EGFR基因或應用EGFR特異性抑制劑會引起骨質丟失[22]。

通過對RA與OP共同靶基因進行GO和KEGG分析發現，GO功能主要富集在在受體配體活性、細胞因子受體結合、細胞因子活性、T細胞活化、肽分泌的調節等方面。KEGG富集結果表明，PI3K-Akt信號通路、JAK-STAT信號通路、破骨細胞分化、HIF-1信號通路及Wnt信號通路等可能是RA與OP病理機制中的共同信號通路。IL-17通過誘導IL-6、TNF-α等促炎因子參與RA滑膜炎癥，PI3K-Akt通路激活可上調IL-17表達，使用該信號通路抑制劑渥曼青霉素能部分或完全阻斷IL-17產生[23]。RA滑膜細胞中PI3K表達增加，可活化PI3K-Akt通路而抑制滑膜細胞凋亡[24]。對于OP來說，PI3K-Akt是骨形成中的關鍵調節途徑，LY294002(PI3K抑制劑)降低了MC3T3-E1細胞的成骨能力[25]。JAK-STAT信號通路由JAK酪氨酸蛋白激酶家族(包括JAK1、JAK2、JAK3等)和轉錄因子STAT家族(包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4等)構成，下調STAT3有助于抑制滑膜細胞存活，該信號通路抑制劑在RA患者中已被證實有效[26]。在OP中IL-6通過調控JAK2/STAT3信號通路影響骨密度及骨小梁生成，阻斷該通路后OP模型大鼠骨密度得到明顯提升[27]。破骨細胞異常活化是引起RA骨質破壞的關鍵因素，RA患者的破骨細胞分化和骨吸收能力明顯增強[28]。成骨細胞骨形成和破骨細胞骨吸收之間保持動態平衡能夠維持骨骼的強度，當骨吸收增強時可導致OP[29]。關節缺氧被認為是RA的重要微環境特征，HIF-1在RA滑膜中大量表達，HIF-1陽性細胞的數量與RA滑膜組織中血管的數量密切相關，抑制HIF-1表達可誘導RA成纖維樣滑膜細胞凋亡[30-31]。缺氧可抑制大鼠成骨細胞的骨形成能力及分化，HIF-1過表達能抑制成骨分化和C3H10T1/2細胞中骨鈣素的表達[32]。TNF-α可誘導RA滑膜細胞中DKK1的表達，DKK1通過抑制經典Wnt信號通路參與RA骨吸收過程[33]。激活破骨細胞前體中的Wnt通路可以抑制破骨細胞分化，Wnt6、Wnt10a和Wnt10b等能夠抑制間充質干細胞向脂肪細胞分化和促進其向成骨細胞分化[34]。

本研究所得RA與OP的關鍵靶點及信號通路中，IL-6、TNF及JAK-STAT通路抑制劑已在臨床中用于治療RA患者，并取得了良好療效。IL-6、TNF等炎性細胞因子介導的破骨細胞分化增強引起的骨代謝失衡，在RA與OP骨質流失中具有一致性。盡管經典Wnt通路對于調節RA與OP骨代謝具有相同意義，但關于拮抗該信號途徑對RA患者骨質破壞方面的獲益尚缺乏研究。HIF-1信號通路的激活不僅引起RA滑膜細胞病理性增殖，也抑制了成骨細胞的骨形成能力，針對該調節通路的研究可能作為治療RA與OP的重要靶點。VEGFA與EGFR在RA與OP中的作用并不一致，其過表達加重了RA滑膜炎癥和血管翳生成，而上調其表達又是促進成骨細胞生成的關鍵，對于VEGFA和EGFR一方面加重RA病理改變、另一方面RA患者卻出現骨質丟失這一矛盾值得進行深入研究。

本研究初步探討了RA與OP之間存在的相同致病基因和相關的信號調節途徑，為探索RA與OP的治療靶點提供了一定理論參考。由于未對上述疾病靶點基因和信號通路進行驗證，本文亦存在一定局限性，需今后進一步研究以明確其具體機制。