骨質疏松患者基因多態性與椎間盤退變的相關性研究

章曉云 李華南* 陳鋒 柴源 甘斌 李松

1.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004

2.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530000

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種廣泛的全身性及慢性疾病，骨量減少及骨微結構破壞是其主要病理特征，易導致低能量骨折。OP是老年人群中最常見的疾病之一，目前影響著全世界約2億人，而且隨著全球老齡化進程日益加劇，其發病率正快速增長[1]。椎間盤退變(intervertebral disc degenerative，IDD)是一種常見的肌肉骨骼疾病，可導致椎間盤突出癥，椎管狹窄，退行性椎體滑脫等脊柱退行性疾病的發生，從而造成人們日常生活質量的下降，并增加醫療成本及社會經濟的負擔[2-3]。隨著生活節奏的加快及生活方式改變，IDD的發病率不斷上升，而且呈年輕化趨勢。OP與IDD之間的發病病理過程均與年齡增長密切相關，兩者的發病機制有相似之處，臨床上很多患者同時患有兩種疾病。研究表明OP對IDD的發病有著顯著影響，但兩者之間存在的相關具體機制尚不清楚[4-5]。

隨著以基因芯片為代表的高通量測序技術的發展，目前可在短時間內獲取疾病的相關信息，進而從基因層面進行更全面的生物標志物篩選。因此，本研究通過GEO數據庫查找OP和IDD血清基因芯片表達譜進行生物學信息學分析，篩選出各自的差異mRNA并進行映射取交集，根據蛋白互作網絡篩選出核心mRNA，最后對其進行富集分析，為確定OP和IDD之間共同發病機理創造條件，并為OP和IDD治療藥物的研發提供有效的作用靶點。

1 材料和方法

1.1 軟件與數據庫

軟件與數據庫見表1。

表1 數據庫與分析平臺Table 1 Involved database and related analysis platform in the study

1.2 數據收集

以“osteoporosis”、“intervertebral disc degeneration”、“human”、“RNA”為關鍵詞，在GEO公共數據庫[6]中檢索與OP及IDD相關的芯片，獲得編號為GSE56116的OP外周血基因表達譜數據，包含10位OP患者和3位健康對照，其所處平臺為GPL4133；獲得編號為GSE56081的IDD髓核組織基因表達譜數據，包含5位IDD患者和5位健康對照，其所處平臺為GPL15314。

1.3 差異基因的數據分析

利用Perl對數據進行重注釋，并利用R語言校正、分類，limma包對基因進行差異分析，再以P<0.05和∣logFC∣≥0.5作為過濾條件，篩選差異基因。最后運用Venny平臺將所得OP和IDD的差異基因進行映射取交集，得到交集基因。

1.4 篩選關鍵基因

使用Cytoscape軟件將交集基因導入，運用Bisogenet插件，在Identifiers下選擇“Gene identifiers only”，限定研究物種為“Homo Sapiens”，同時在Data Settings下選擇“Protein Protein Interaction”，構建直接或間接蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網絡。并運用CytoNCA插件進行拓撲分析，篩選出節點連接度(degree，DC)>80和節點介度(betweenness，BC)>2 000的基因[7]，構建PPI核心網絡圖，獲取所獲取的基因是直接或間接調控發揮治療OP和IDD作用的關鍵基因。

1.5 關鍵基因的基因本體論(gene ontology，GO)分析

利用DAVID數據庫[8]對關鍵基因進行GO功能富集分析，通過統計學P值和FDR值來評估GO生物過程 ( BIOLOGICAL PROcess) ，研究關鍵基因在OP和IDD發生發展過程中的主要生物功能。

1.6 關鍵基因的京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析

利用DAVID數據庫對關鍵基因進行KEGG功能富集分析，根據所富集的通路功能條目，探究OP和IDD發生發展相關的信號通路。

2 結果

2.1 差異基因的分析

對OP芯片進行分析，共得到971個明顯改變的基因，其中上調基因541個，下調基因430個；對IDD芯片進行分析，共得到9 125個明顯改變的基因，其中上調基因4 764個，下調基因4 361個。將2組差異基因分別繪制成火山圖，見圖1。圖中黑色的點代表無差異基因，綠色的點代表下調基因，紅色的點代表上調基因。同時在上調和下調的基因中分別選取差異最顯著的10個基因繪制差異基因熱圖，見圖2。

2.2 交集基因的獲取

將OP和IDD的差異基因上傳至Venny平臺進行映射取交集，共得到205個交集基因，見圖3。該205個交集基因在OP與IDD的發生發展中均發揮著重要作用。

2.3 PPI網絡及拓撲分析

利用Cytoscape的Bisogenet插件構建PPI網絡，共涉及3 242個節點、 69 536條邊。再利用CytoNCA插件進行拓撲分析，設置DC>80，獲得465個節點，16 635條邊的網絡。最后設置BC>2 000，獲得一個涉及8個節點，17條邊的PPI核心網絡，見圖4。結果表明UBC、YWHAZ、TP53、CUL3、NTRK1、BRCA1、Mcm2、ESR1排名靠前，在整個網絡中起著關鍵作用，可能是治療OP與IDD的關鍵靶點，其基本信息見表2。

表2 關鍵基因的基本信息Table 2 The basic information on the key genes

2.5 GO功能分析

利用DAVID數據庫對8個關鍵基因進行GO功能分析，共確定571條生物過程，主要涉及蛋白質-DNA復合物組合、蛋白質-DNA復合物亞基組織、蛋白質去泛素化、蛋白質小分子修飾、染色體組織的調控等過程。GO分析結果得出的結果與OP和IDD的發生發展過程密切相關。選取富集前15位進行圖片展示，見圖5。

2.6 KEGG富集分析

使用DAVID數據庫對8個關鍵基因進行KEGG富集分析，共確定14個KEGG信號通路條目，主要涉及PI3K/Akt信號通路、泛素介導的蛋白質水解、線粒體自噬、影響細胞周期及凋亡相關通路、神經營養素信號通路、甲狀腺激素信號通路等。選取全部結果進行圖片展示，見圖6。

3 討論

椎間盤退變是下腰痛的主要發病誘因，經常導致腰椎間盤狹窄、椎間盤突出、椎體滑脫等脊柱退行性疾病的發生，嚴重影響患者的生活質量。隨著人口老齡化加劇，脊柱退行性疾病往往伴隨著骨質疏松，尤其是絕經后女性，體內雌激素的迅速下降導致骨密度降低，骨質量下降，骨質疏松發生率較高，而且椎間盤退變更嚴重。因此本研究通過生物信息學分析了解OP與IDD之間的相關性，篩選兩者發病的共同基因，闡釋兩者之間的相關發病機理，為藥物研發提供一定的參考資料。

本研究通過GEO數據庫查找獲取OP血清基因表達芯片GSE56116和IDD血清基因表達芯片GSE56081，對兩種芯片進行生物學信息分析共獲得205個交集基因并對其進行拓撲分析，結果表明UBC、YWHAZ、TP53、CUL3、NTRK1、BRCA1、Mcm2、ESR1可能是治療OP與IDD的關鍵靶點。研究表明骨質疏松癥的發生與成骨細胞和破骨細胞之間介導的骨穩態密切相關[9]，骨穩態的平衡還可保證脊柱生物力學的穩定性，可減少IDD的發生幾率[10-11]。骨穩態涉及骨形成與骨吸收之間的動態平衡，研究表明UBC在血管生成及骨形成過程中是必不可少的，其可促進骨膜血管生成并提高成骨細胞的活性[12]，而TP53在原發型骨質疏松癥被上調并發揮著重要作用，其抑制表達后同樣可促進機體血管形成和成骨作用減緩骨質疏松病情發展[13]。另有研究[14]表明UBC與TP53參與了IDD發生發展，可能是IDD的潛在治療靶標。因此筆者認為UBC與TP53通過調節機體骨穩態從而影響OP與IDD疾病的發生與發展。研究[15]表明YWHAZ是治療骨質疏松癥的關鍵靶點，YWHAZ表達抑制對骨礦化，成骨細胞分化和骨形成發揮抑制作用，從而影響OP的發生和發展。生物信息學研究[16]表明YWHAZ和TP53與IDD的發生發展密切相關，是治療IDD的關鍵基因。CUL3在Spop介導的泛素化過程中發揮作用從而影響機體軟骨細胞和成骨細胞分化，增加骨密度，促進人體骨骼發育，為臨床上骨質疏松、椎間盤退變、骨關節炎等疾病的診斷與治療提供潛在的靶標[17]。NTRK1基因的突變會影響人體礦物質不足，骨質形成缺陷，引起人體出現復發性骨折和骨質疏松，進而影響脊柱的穩定性，增加椎間盤退變的發生機率[18]。雌激素通過多種途徑影響破骨細胞、成骨細胞、免疫細胞和其他細胞的功能從而維持骨礦物質密度至關重要。研究[19]表明ESR1的多態性與人類的骨量相關，在OP發生發展過程中發揮著重要作用，另有研究[20]發現ESR1表達差異會引起人體椎間盤及髓核病理改變誘發椎間盤退變。BRCA1的表達增加導致雌激素受體介導的轉錄受到抑制從而影響機體的骨形成導致骨質疏松發生[21-22]，而BRCA1損傷后會導致椎間盤退變引起脊柱退行性變的發生[23]。因此筆者認為UBC、YWHAZ、TP53、CUL3、NTRK1、BRCA1、ESR1等共同調控OP與IDD的發生發展，它們會誘發椎體骨質疏松，進而引起椎體承受壓力能力減弱而導致壓力往椎間盤上轉移，從而引起椎間盤彈性減低，髓核持續受壓后導致其突出概率增大。

為充分了解關鍵基因在OP與IDD中涉及的共同通路及功能，我們進行了GO 及KEGG分析。GO結果顯示靶基因主要通過蛋白質-DNA復合物組合、蛋白質-DNA復合物亞基組織、蛋白質去泛素化、蛋白質小分子修飾、染色體組織的調控等過程，這些生物過程參與成骨細胞增殖分化、細胞凋亡，從而影響機體骨穩態，造成骨量丟失，造成骨質疏松的同時引起椎體生物力學失衡，進而導致椎間盤退變。KEGG分析結果顯示信號通路主要涉及PI3K/Akt信號通路、泛素介導的蛋白質水解相關通路、線粒體自噬相關通路、影響細胞周期及凋亡相關通路、神經營養素信號通路、甲狀腺激素信號通路等。研究[25]表明FoxO1通過PI3K/AKT途徑發生磷酸化從而影響代謝，細胞周期變化及細胞死亡等生物過程，進一步調控骨代謝以改善骨質內微觀結構，骨密度及強度，可有效延緩OP病情進展，減少IDD的發生。與GO分析結果一樣，KEGG也同樣顯示泛素介導的蛋白質水解相關通路與影響細胞周期及凋亡相關通路在OP與IDD的發生發展過程中發揮著重要作用。研究表明泛素蛋白酶體系統通過靶向蛋白質底物進行泛素化，在調節成骨細胞和破骨細胞的分化功能介導骨重塑過程中發揮著重要作用，可影響成骨細胞周期及凋亡，調控骨穩態平衡影響OP發生發展，進而導致椎體骨質流失引起IDD發生。自噬和線粒體自噬在成骨細胞分化，礦化和存活過程中發揮著關鍵作用，越來越多的證據表明成骨細胞自噬和線粒體自噬是OP發病機理中的一種新機制[24]。線粒體功能障礙，氧化應激和髓核細胞凋亡是IDD發生和發病的重要因素，研究[25-28]已證實Parkin介導的線粒體自噬通路激活可有效減輕椎間盤退變。人體在正常生理狀態下，成骨與破骨細胞之間的功能平衡才能維持機體骨穩態的正常。研究表明自噬可通過調節骨髓間充質干細胞、成骨細胞及破骨細胞的功能狀態參與機體骨穩態的維持，自噬水平降低會導致細胞成骨分化能力減弱，破骨細胞活性增強，從而導致骨穩態失衡引起人體骨質丟失，最終導致OP的發生。OP是全身性疾病，各椎體出現骨質疏松后，其強度和硬度降低，進而影響各椎體承受壓力的大小，當椎體受到以往同樣的外界壓力后，其力量會傳導至椎間盤，最終引起OP與IDD在同一位患者中相繼出現。椎間盤變性與局部炎癥和神經營養蛋白的表達增加有關，神經營養素信號通路的激活可引起神經營養蛋白增加減輕IDD病情[30-31]。人體與動物實驗研究[32-33]均表明骨骼與神經系統之間存在密切關聯，骨骼細胞與神經組織之間的聯系對于促進骨骼的生長，體內平衡和修復非常重要，神經營養蛋白基因表達異常是OP發病的危險因素。吳毅華等[34]研究表明甲狀腺激素輔助治療頸椎退行性椎間盤疾病合并骨質疏松癥患者，可有效提高骨密度及成骨相關基因，臨床療效顯著，而生物信息學實驗驗證表明甲狀腺激素在OP發病過程中起著關鍵作用[35]，因此甲狀腺激素通路是否激活對于OP與IDD病情發生發展至關重要。

總之，OP和IDD均存在龐大的疾病基因網絡，但這些網絡并非各自獨立，而是存在密不可分的聯系。本研究獲得OP和IDD各自疾病基因網絡的交叉部分正是二者相關聯的部分，也是研究OP和IDD相互關系的突破點，同時也可為藥物同時干預兩種相互關聯的疾病提供較為可靠的路徑和作用靶點。且從側面反映出不同疾病可通過應用同一藥物治療的特色，與中醫辨證論治中的“異病同治”思想不謀而合，以此促進中藥現代化發展。為臨床兩種疾病治療提供一定的臨床指導，讓醫生及患者了解兩種疾病合并治療的重要性。此外該研究尚存在一些缺點，首先，由于篩選條件的限制，只能對主要蛋白基因、作用靶點、信號通路進行分析，在一定程度上使得研究結果具有局限性；其次，對差異基因信息進行整合處理依賴于生物信息學技術的發展，疾病數據庫的完整性、準確性直接決定著整合后信息的可靠性。故本文雖然能夠篩選出大量靶點和通路，但仍需后續結合體內外實驗進一步驗證與支持，使理論更加可靠。