芝麻素對大鼠骨質疏松癥的作用研究

馬忠平 葉楠 張志峰 楊毅峰 楊云

內蒙古醫科大學第二附屬醫院關節外科，內蒙古 呼和浩特 010030

骨質疏松癥(osteoporosis, OP)是最常見的骨骼疾病, 是一種以骨量低，骨組織微結構損壞，導致骨脆性增加，易發生骨折為特征的全身性骨病[1]。骨質疏松癥通常無癥狀或輕微，是臨床病理性骨折的常見原因，也是影響人類健康高危因素之一[2]。相關研究[3-4]報道，世界范圍內，骨質疏松癥在超過50歲人群中的影響率為15%，在80歲以上的人群中其影響率為70%。骨質疏松癥的患病人群中，2%～8%的男性和9%～38%的女性受到骨質疏松癥及相關并發癥的嚴重影響[5]。目前全世界近5 000萬人患有骨質疏松癥，超過1 800萬人骨量低于正常，形成了龐大的骨質疏松癥的高危人群[4]。近期研究[6-7]指出，遺傳因素、生理、環境和生活方式對骨量均有重要影響，手術切除卵巢、酒精中毒、甲狀腺機能亢進、厭食癥、腎臟疾病等多種疾病可以誘發骨質疏松癥，另外，化療、抗癲癇藥物、質子泵抑制劑、糖皮質激素藥物和選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑等一些藥物也可以引起骨質疏松癥。骨質疏松癥其發病相關分子機制尚未明確，臨床表現及預后均較為復雜，且病程遷延，尚未有有效治療方法。

芝麻素是從花椒植物的表皮和芝麻油中分離得到的一類木脂素，通常被用作膳食減脂補充劑。其主要代謝產物是腸內酯，半衰期小于6 h。芝麻素是芝麻油的次要成分，平均僅占芝麻油總重量的0.14 %[8-9]。Orawan等[10]證實芝麻素可以通過激活p38和ERK/MAPK途徑來觸發人類胎兒成骨細胞和人類脂肪來源干細胞的成骨分化。相關研究指出，芝麻素通過調節Wnt/b-catenin信號通路可以促進大鼠骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，其對重塑大鼠骨結構有一定影響。然而，芝麻素對骨質疏松癥的作用影響鮮有研究，故而在病理狀態下，芝麻素對骨代謝是否有影響尚不得而知。本研究建立OVX大鼠模型，進行大鼠的芝麻素灌胃干預，行Micro-CT并檢測OCN含量以及I型膠原表達，以探究芝麻素對骨質疏松癥大鼠的骨誘導作用，進一步為應用芝麻素治療骨質疏松奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 芝麻素制備

芝麻素(S9314，Sigma-Aldrich)使用二甲基亞砜(DMSO，Sigma) 溶解為14.22 mmol/L的溶液，儲存于-20 ℃。

1.2 大鼠飼養

Sprague Dawley(SD)大鼠購自內蒙古醫科大學第二附屬醫院醫學實驗動物中心。雌性SD大鼠18只，10個月齡，體重(72±6) g，維持標準大鼠飲食和自由飲水，飼養于溫度(22±2) ℃，濕度(50±5)%，12 h光暗循環的動物室內。所有動物實驗均按照國家衛生研究院“實驗動物護理原則指南” 進行(NIP出版物85-23, 1996年修訂)，并經內蒙古醫科大學實驗動物倫理委員會批準(項目編號為2017032, 日期為2017年7月15日)。

1.3 去卵巢(ovariectomized, OVX)大鼠模型制備

共18只SD大鼠采用隨機數字表法分為3組(每組6只)：OVX組(去卵巢大鼠未干預)、OVX+S(去卵巢大鼠芝麻素干預)組和Sham組(假手術)。OVX組和OVX+S組大鼠進行雙側卵巢切除，建立低雌激素水平的OVX模型。Sham組大鼠卵巢膜脂肪組織暴露后縫合。3組SD大鼠手術條件及手術時間均相同。

1.4 芝麻素灌胃干預

OVX+S組大鼠在上午10:00至上午12:00之間給予芝麻素(80 mg/kg)灌胃，每天1次；OVX組和Sham組大鼠在相同時間給予生理鹽水(0.9%)灌胃，每天1次。實驗組以及對照組其他條件均相同，大鼠連續喂養12周。

1.5 大鼠股骨Micro-CT測量

連續飼養12周后，所有研究大鼠均用戊巴比妥鈉(150 mg/kg)(Sigma)進行安樂死。分離大鼠股骨，并去除周圍的軟組織。股骨樣品在4%多聚甲醛中固定72 h。使用Micro-CT系統(SCANCOCT80; Medical AG)，固定參數設置為55 kV及145 μA，測量參數包括骨密度(bone mineral density, BMD)、骨小梁數量(trabecular number, Tb.N)和小梁間距(trabecular spacing, Tb.Sp)，可視化定量分析股骨三維微結構。

1.6 大鼠股骨OCN的免疫組織化學(IHC)檢測

大鼠股骨標本由2名病理科醫師共同切片。將切片的股骨樣本于70 ℃下干燥30 min。脫蠟和逐級乙醇水合后，將切片EDTA孵育30 min，后于37 ℃下經3% H2O2孵育30 min。給予山羊血清于37 ℃封閉30 min，后與兔抗鼠骨鈣素(OCN)抗體(1∶100，ab13420，Abcam)于4 ℃的濕盒中孵育過夜。添加山羊抗兔IgG H&L(HRP)(1∶1 000，ab6721，Abcam)于37 ℃孵育30 min。室溫條件DAB(碧云天)染色及蘇木精-伊紅(H&E)(碧云天)染色，顯微鏡下觀察樣本顏色變化，及時終止。逐級脫水后，中性樹脂密封切片。Image-Pro Plus 6.0分析陽性OCN的OD值。

1.7 大鼠股骨I型膠原的免疫熒光(ICC/IF)檢測

大鼠股骨標本由2名病理科醫師協商切片。將切片的股骨樣本于70 ℃下干燥30 min。脫蠟和逐級乙醇水合后，將切片EDTA孵育30 min，后于37 ℃下經3% H2O2孵育30 min。給予山羊血清于37 ℃封閉30 min，使用兔抗鼠Ⅰ型膠原(1∶500，ab34710，Abcam)抗體于25 ℃孵育1 h。加入Fluor?488山羊抗兔抗體(1∶500，ZSGB)室溫(25 ℃)避光孵育1 h。后經DAPI核染，激光共聚焦顯微鏡觀察切片。結果經Image-Pro Plus軟件進行分析。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 芝麻素處理大鼠后對各組股骨Micro-CT結果的影響

芝麻素對預防和治療骨質疏松癥有積極作用，在圖1中，Micro-CT顯示OVX組BMD(F=34.84,P=0.000 3)及Tb.N(F=13.12，P=0.003 7)低于sham組，而Tb.Sp(F=64.16，P<0.000 1)高于Sham組，表明骨質疏松大鼠的建模成功。與OVX組相比，OVX+S組大鼠BMD (T2=6.737，P<0.05)增加，Tb.Sp(T2=7.124，P<0.05)降低，Tb.N差異無統計學意義。OVX+S組和Sham組的BMD和Tb.N差異無統計學意義，但Tb.Sp差異具有統計學意義(T3=3.769，P<0.05)。

2.2 芝麻素處理大鼠后各組股骨中OCN的免疫組化表達

圖2顯示OVX組(t=5.083，P<0.0 5)和OVX+S組(t=3.995，P<0.05)的OCN明顯低于Sham組。OVX+S組OCN高于OVX組，組間差異無統計學意義。

2.3 芝麻素處理大鼠后各組股骨中I型膠原的免疫熒光表達

圖3顯示OVX組I型膠原低于Sham組(t=10.40，P<0.05)。OVX+S組和Sham組I型膠原水平相近，組間差異無統計學意義。

3 討論

本研究中，Micro-CT證實了成功建立的OVX大鼠模型，該模型具有較低的BMD和Tb.N，且具有較高的Tb.Sp，與臨床表征相符。給予80 mg/kg芝麻素灌胃可提高去勢大鼠股骨BMD和Tb.N，降低Tb.Sp，對去勢的骨質疏松癥模型的骨量丟失有抑制作用。同時IHC及ICC/IF可知芝麻素對OCN和I型膠原的丟失具有預防作用并可促進OCN和I型膠原的產生。以上結果表明芝麻素(80 mg/kg)對骨骼結構具有保護作用。

所有人在老年階段都會經歷骨密度下降[11]。圍絕經期婦女在早期存在更快速度的骨量丟失，導致更高的骨折風險[12]。性腺功能減退是導致男性骨密度下降的重要危險因素[13]。一些生物標志物已被證實在骨質疏松的發展中具有重要檢測意義。BMD、Tb.N以及Tb.Sp已被證實與骨質疏松密切相關，與健康人相比，骨質疏松患者的BMD和Tb.N通常較低而同時Tb.Sp較高。此外，OCN以及I型膠原為骨質主要成分，其降低在骨質疏松癥的相關檢測指標中最具代表性[14]。

前期研究[15]已經證明芝麻素可以通過激活p38和ERK/MAPK途徑以及Wnt/b-catenin信號通路誘導成骨分化。本研究中，芝麻素處理提高了BMD、Tb.N、OCN以及I型膠原水平，而下調了Tb.Sp水平，表明芝麻素在大鼠機體復雜結構環境中亦具有促進成骨的能力，其對本實驗條件下大鼠的骨量丟失具有保護作用，對骨質疏松具有治療和預防作用。以芝麻素為切入靶點的基于人體的相關研究厄待開展。

綜上，本研究初步證實芝麻素對大鼠骨質疏松癥有一定的治療和預防作用，為進一步探究芝麻素對人骨質疏松癥的臨床治療作用奠定理論基礎。

注：與Sham組比較，*P<0.05；與OVX組相比，#P<0.05。圖3 芝麻素處理大鼠后各組股骨中I型膠原的免疫熒光表達Fig.3 Immunofluorescence expression of type I collagen in the femurs after administration of different dose of sesamin in rats