乳源性復合益生菌對CT-26荷瘤小鼠抗腫瘤作用研究

木拉提艾則·玉素甫，阿合力·那斯肉拉，沈芳，王玉星，新華·那比

（1.新疆醫科大學 藥學院，烏魯木齊 830002；2.新疆醫科大學附屬腫瘤醫院綜合特需科，烏魯木齊 830011）

0 引言

結腸癌（Colorectal Cancer,CRC）是臨床最常見的胃腸道惡性腫瘤，具有早期隱蔽性較高、病情發展迅速、高死亡率等特點，目前全球死亡率居所有惡性腫瘤的第3位，5年生存率約40%～60%[1]。以氟尿嘧啶為主的藥物化療是晚期結腸癌患者最主要的治療方法，但化療藥物在殺傷腫瘤細胞的同時對其他正常細胞亦有損害，從而影響患者的生活質量和治療效果[2]。因此尋找一個低毒高效并且能夠增強機體免疫功能的抗腫瘤藥物成為了目前研究的熱點。

腫瘤的發生與發展與機體自身免疫系統密切相關，T淋巴細胞是機體調節免疫反應中最主要的效應細胞[3]。根據分型不同可分為表達CD4+的輔助性T細胞（Helper T cells，Th）及表達CD 8+的細胞毒性T細胞（Cytotoxic T cell，CTL）[4]。Th細胞則又可分為Th1和Th2，其中Th1主要分泌IL-2、IFN-γ等細胞因子輔助CTL分化和增殖，從而介導抗腫瘤的細胞免疫應答，而Th2則主要分泌IL-10等細胞因子介導體液免疫，從而抑制Th1的增殖[5]。T淋巴細胞亞群的檢測對惡性腫瘤的診斷、治療及預后均有重要意義，研究表明腫瘤發生時會影響機體的免疫功能，導致T淋巴細胞CD4+/CD8+T細胞的比值降低，Th1/Th2比例失衡[6]。此外，CD4+T細胞的亞群調節性T細胞（Treg）也在維持免疫系統穩定中也起到關鍵作用，Treg細胞在腫瘤微環境中大量增加，抑制了免疫系統對癌細胞的免疫應答，導致腫瘤細胞免疫逃逸，抑制抗腫瘤免疫的功能[7]。腫瘤組織內浸潤高密度的Treg細胞常提示了較差的臨床預后，Treg細胞中Foxp3是最具有特異性和調節性的標記物，該標記物會影響Treg活化及其功能穩定的各種分子導致腫瘤免疫抑制及免疫逃逸[8-9]。

益生菌一直是國內外研究的熱點,對于益生菌在調節腸道菌群、預防糖尿病、提高機體免疫力等方面作用已被熟知[10-13]。目前對益生菌研究重點轉為它們對免疫系統的調控作用和抗腫瘤方面的作用機制。在一項臨床實驗中將益生菌丁酸梭菌MI-YAIRI 588作為干預措施用于癌癥患者臨床治療，結果表明MI-YAIRI 588治療能夠延長腫瘤患者的總生存期[14]。再另一項研究中；研究者通過從健康人腸道中刷選出11株具有抗腫瘤免疫潛能的有益菌群，發現11株菌的復合定植具有增強腫瘤模型小鼠的ICB免疫療法的作用[15]。本課題組前期研究表明，駝乳源性4種復合益生菌能夠部分緩解環磷酰胺對小鼠免疫抑制作用,調節Th1/Th2平衡,起到免疫調節和保護作用[13]。本研究旨在評價駝乳源性復合益生菌對CT-26荷瘤小鼠抗腫瘤免疫功能的影響，為臨床治療提供更多藥理學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

3種乳酸菌及一種酵母菌均通過傳統發酵的方法，將來源于乳源性發酵的駝乳及乳酪乳清中提取的4種復合益生菌，分別為；東方伊薩酵母菌(Issatchenkia orientalis)、高加索酸奶乳桿菌(Lactobacillus kefir)、馬乳酒樣乳桿菌(Lactobacillus kefiranofaciens),戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus),并由中國農業科學院微生物研究所鑒定[16-17]。

1.1.2 動物

SPF級健康雌性BALB/C小鼠50只，平均體質量（16±2）g，周齡6周，由新疆醫科大學動物實驗中心提供。生產許可證號；SCXK（新）2018-0002。飼養環境為光照12 h/d,室溫(21±2)℃,濕度為50%±5%,普通飼料喂養。

1.1.3 瘤株

CT26.WT小鼠結腸癌細胞（貨號：ZQ 0190），由上海中喬新舟生物科技有限公司所提供。

1.1.4 試劑

MRS肉湯培養基、麥芽汁液體培養基、MRS瓊脂培養基、沙氏瓊脂培養基均，青島日水生物技術有限公司；氟尿嘧啶注射液（批準文號：國藥準字H 31020593），上海旭東海普藥業有限公司；FBS(胎牛血清，批號：10099-141），Gibco；Penicillin-Streptomycin雙抗(批號：51H 351），ExCell Bio公司；DMSO(二甲基亞砜，批號：1213C0314;北京索萊寶科技有限公司);RPMI1640培養基（Hyclon）紅細胞裂解液（批號：BL503B），biosharp公司；CD 4、CD 8抗體，eBioscience公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（貨號：C0105S），上海碧云天；IL-2 ELISA試劑盒（批號：XY-091202M）、IL-10 ELISA試 劑 盒（批 號：XY-091210M）、IFN-ELISA試劑盒（批號：XY-090617M），上海優選生物科技有限公司。

1.1.5 儀器與設備

CO2培養箱，Thermo Corporation；流式細胞儀，American BD；酶聯檢測儀，American Bio-RAD；AY120電子分析天平，日本島津；TDL-5A離心機，上海菲恰爾分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物造模

將CT 26.WT結腸癌細胞置于完全培養基中培養并傳代,將處于對數生長期的細胞制成濃度為1×107/mL的細胞混懸液，取40只BALB/C小鼠,于小鼠右腋下部位皮下接種200μL。小鼠成瘤接種后，每天檢查腫瘤生長情況,全程均采取無菌操作,待腫瘤生長至約2～5 mm后，觸摸有不規則的硬塊，既模型建立成功。

1.2.2 動物分組、給藥

將種瘤小鼠小鼠隨機分為4組，既；模型組、陽性對照組（5-Fu）、復合益生菌高劑量組、復合益生菌低劑量組，另取未種瘤的正常BALB/C小鼠做正常對照，每組10只。5-Fu組以25 mg/kg（用生理鹽水配置，現配現用）腹腔注射給藥，每2 d一次，復合益生菌組高低劑量組分別灌胃給與（乳桿菌1.0×1010CFU/d+酵母菌1.0×108CFU/d及乳桿菌1.0×108CFU/d+酵母菌1.0×106CFU/d，0.3 mL），空白組與模型組每天以0.9%生理鹽水灌胃，連續21 d，開始給藥后每3 d使用游標卡尺測量各組荷瘤小鼠的腫瘤長徑和短徑。

1.2.3 檢測體質量、瘤重、抑瘤率和脾臟指數

末次給藥24 h后分別無菌條件剝取腫瘤組織、胸腺組織及脾臟組織,精密稱定質量后,分別計算抑瘤率及臟器指數。

1.2.4 腫瘤組織病理學

分別取各組小鼠完整腫瘤組織，于4%中性甲醛固定，并用常規石蠟包埋，再將石蠟包埋塊切片、脫蠟，進行HE染色，后用掃描儀對切片進行圖像掃描。

1.2.5 流式細胞術檢測T淋巴細胞亞群

各組脾臟經無菌針頭穿刺、PBS沖洗、用200目篩網研磨過濾調整細胞濃度為1×106/mL的單細胞混懸液。后加入500μL紅細胞裂解液，1 000 r/min離心3 min，棄上清。PBS重懸細胞，加入FITC-CD4和APC-CD8a抗體，各5μL。4℃避光孵育15 min，PBS洗滌兩次后重懸細胞，流式細胞儀上機檢測。并計算CD4+/CD8+T細胞比值比值。

1.2.6 免疫熒光檢測Foxp3+Tregs密度

各組腫瘤組織石蠟切片常規脫蠟，用0.01 mol/L PBS(p H 7.4)洗滌10 min×3次,加封閉液,加入Foxp3一抗（1∶300稀釋）、4℃過夜。加入二抗（抗兔，1∶100稀釋）后，激光共聚焦下觀察Foxp3染色情況。

1.2.7 Elisa法檢測血清IL-2、IL-10、IFN-γ含量

EP管收集各組荷瘤小鼠血液標本，4℃、3 000 r/min離心20 min，收集血清，根據試劑盒說明書步驟操作，計算出血清IL-2、IL-10、IFN-γ含量。

1.2.8 統計學處理

2 結果與分析

2.1 復合益生菌對CT-26荷瘤小鼠的影響

各組荷瘤小鼠腫瘤生長曲線如圖1(a)所示，與模型組比較，復合益生菌高、低劑量組以及5-氟尿嘧啶組小鼠腫瘤生長速度相對緩慢；從給藥第10日起，復合益生菌高劑量組和5-氟尿嘧啶組小鼠腫瘤體積均顯著小于模型組（P＜0.05）；復合益生菌低劑量組腫瘤雖有生長緩慢趨勢，但是無統計學意義。各組小鼠腫瘤給藥21 d后，腫瘤實物圖如圖1(b)所示，經過稱重及計算結果如表1所示，復合益生菌高組以及5-氟尿嘧啶組荷瘤小鼠腫瘤重量均顯著小于模型組（P＜0.05），與模型組比較復合益生菌低劑量組腫瘤質量無統計學意義，5-氟尿嘧啶組、復合益生菌高劑量組、復合益生菌低劑量組抑瘤率分別為81.65%、41.49%、17.00%。說明乳源性復合益生菌具有一定程度減緩腫瘤生長的作用。

表1 各組CT-26荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率比較(n=10,±s)

表1 各組CT-26荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率比較(n=10,±s)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量 瘤體質量/g 腫瘤抑制率/%模型組 - 4.94±0.67 -復合益生菌高劑量組乳酸菌1.0×1010酵母菌1.0×108 2.89±1.01** 41.49復合益生菌低劑量組乳桿菌1.0×108酵母菌1.0×106 4.10±0.54 17.00 5-氟尿嘧啶組 25 mg·kg-1 0.91±0.41** 81.65

圖1 復合益生菌和5-氟尿嘧啶處理對CT-26荷瘤小鼠重量生長曲線和瘤質量的影響(n=10,±s)

2.2 復合益生菌對荷瘤小鼠免疫器官指數的影響

由表2可見，與空白組比較；模型組荷瘤小鼠脾臟指數顯著降低（P＜0.01），與模型組比較，復合益生菌低劑量組、5-Fu組脾臟指數雖有升高趨勢但無顯著性差異（P＞0.05）。復合益生菌高劑量組脾臟指數顯著性升高差異有統計學意義（P＜0.05）；與空白組比較模型組胸腺指數顯著性降低（P＜0.01），與模型組比較復合益生菌高、低劑量組均能提高荷瘤小鼠胸腺系數，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），而5-氟尿嘧啶組差異無統計學意義（P＞0.05）。說明乳源性復合益生菌在減緩腫瘤生長的同時，對荷瘤小鼠免疫器官具有一定的保護作用，提示乳源性復合益生菌的抗腫瘤作用與免疫有關。

表2 各組CT-26荷瘤小鼠脾臟和胸腺指數比較(n=10,±s)

表2 各組CT-26荷瘤小鼠脾臟和胸腺指數比較(n=10,±s)

注：P#＜0.05，P##＜0.01VS正常組；P*＜0.05，P**＜0.01VS模型組。

組別 劑量 臟器指數脾臟指數 胸腺指數空白組 - 7.08±0.51 1.51±0.44模型組 - 4.89±0.22## 0.84±0.12##復合益生菌高劑量組 乳酸菌1.0×1010酵母菌1.0×108 6.97±0.69* 1.16±0.15**復合益生菌低劑量組 乳桿菌1.0×108酵母菌1.0×106 5.04±0.57 1.38±0.34*5-氟尿嘧啶組 25 mg·kg-1 5.12±0.76 0.70±0.35

2.3 復合益生菌對荷瘤小鼠腫瘤組織病理學影響

模型組腫瘤細胞呈橢圓形，細胞核大，細胞形態完好，腫瘤細胞數目較多，壞死區域較少；與模型組比較，復合益生菌高、低劑量組腫瘤細胞數目減少，腫瘤細胞密度降低以及存在部分壞死區域，但不及5-氟尿嘧啶組。此外符合益生菌高、低均出現不同程度免疫細胞浸潤的現象，如圖2所示。

圖2 復合益生菌對荷瘤小鼠腫瘤組織病理學變化的影響(HE染色，×100)

2.4 復合益生菌對荷瘤小鼠脾臟中CD4+/CD8+T細胞的影響

由表3可見，與正常組比較，模型組小鼠脾臟CD4+T細胞含量顯著降低（P＜0.01），CD8+T細胞比例顯著升高（P＜0.01）,CD4+/CD8+T細胞比例降低（P＜0.01）;與模型組比較，復合益生菌低劑量組CD4+T細胞升高，但無統計學差異（P＞0.05），CD8+T細胞含量顯著降低（P＜0.05），CD4/CD8+T細胞比例具有升高趨勢，但無統計學差異（P＞0.05）；與模型組比較，復合益生菌高劑量組CD4+T細胞升高（P＜0.01），CD8+T細胞含量顯著降低（P＜0.05），CD4+/CD8+T細胞比例顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，5-Fu組CD 4+T細胞比例顯著降低（P＜0.05），CD8+T細胞比例升高（P＞0.05），CD4+/CD8+T細胞比例降低（P＜0.05）。說明乳源性復合益生菌可以調節荷瘤小鼠CD4+/CD8+T的比值，可能是通過對T淋巴細胞的調控作用，從而提高荷瘤小鼠的抗腫瘤免疫。

表3 復合益生菌對荷瘤小鼠脾臟T淋巴細胞亞群的影響(n=10,±s)

表3 復合益生菌對荷瘤小鼠脾臟T淋巴細胞亞群的影響(n=10,±s)

注：P#＜0.05，P##＜0.01VS正常組；P*＜0.05，P**＜0.01VS模型組。

組別 CD4+T CD8+T CD4+/CD8+T正常對照組 49.98±5.58 15.18±2.61 3.38±0.79模型組 27.36±5.14## 29.85±6.92## 0.97±0.34##低劑量組 31.83±3.28 23.23±3.07* 1.40±0.30高劑量組 37.88±6.84** 20.9±4.81** 1.87±0.44**陽性藥組 15.85±6.80* 31.45±3.46 0.50±0.23*

2.5 復合益生菌對各組小鼠瘤組織Foxp3+Treg浸潤的影響

由圖3可見，Foxp3染色密度；與模型組比較，復合益生菌高劑量組、陽性藥組Foxp3密度明顯降低，而復合益生菌低劑量組無明顯差異。

圖3 各組小鼠腫瘤組織Foxp3+Treg免疫熒光染色觀察

2.6 復合益生菌對荷瘤小鼠血清免疫因子水平的影響

如圖4所示，與正常組比較，模型組小鼠血清中免疫因子IL-2、IFN-γ水平顯著下調（P＜0.05），IL-10水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，復合益生菌高劑量組小鼠血清中IL-2水平顯著升高（P＜0.01），IFN-γ水平顯著升高(P＜0.01)，IL-10水平顯著性下降（P＜0.05）。與模型組比較；復合益生菌低劑量組IL-2、IFN-γ水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），IL-10水平雖有下降，但無統計學差異（P＞0.05)。

圖4 小鼠血清中IL-2、IFN-γ、IL-10等細胞因子的分泌水平

3 討論

隨著我國結直腸癌的發病率與死亡率逐年升高，結直腸的治療與預防已成為一項人類面臨著的巨大挑戰。腫瘤治療傳統方法是依靠外界力量殺死腫瘤細胞，作用靶點是腫瘤細胞，而目前新型腫瘤免疫治療是利用免疫系統、恢復機體正常的抗腫瘤免疫反應，從而控制與清除腫瘤的一種治療方法[18]。Li等研究表明，名為Prohep的益生菌混合物可使HCC荷瘤小鼠腫瘤體積減小40%，其機制可能是通過降低腫瘤微環境中的炎癥因子，通過改善小鼠腸道中的抗炎性環境來實現的[19]。Hatmal等通過體外試驗驗證了開菲爾乳對人體慢性粒細胞白血病細胞K562和結腸癌細胞HCT 11均有一定的抑制作用[20]。而不同菌株益生菌益生特性具有一定的差異，在本研究中乳源性復合益生菌高、低劑量組均可使CT-26荷瘤小鼠腫瘤質量不同程度的降低，其中復合益生菌低劑量組抑瘤率為17%，復合益生菌高劑量組抑瘤率為41.49%。此外復合益生菌高、低劑量組小鼠胸腺指數和脾臟指數均有不同程度的增加，提示乳源性復合益生菌減緩CT-26荷瘤小鼠腫瘤體積的同時，對荷瘤小鼠的臟器指數具有一定的保護作用。脾臟和胸腺為機體重要的免疫器官，是發生免疫應答及合成免疫活性物質的重要場所，脾臟和胸腺指數在一定程度上反映了機體免疫功能的強弱。這提示駝乳源性復合益生菌發揮抗腫瘤作用的機制可能是通過提高機體免疫功能途徑。

有研究表明腫瘤患者的CD4+T細胞亞群比例下降，CD8+T細胞亞群相對升高，CD 4+/CD8+T細胞比值的降低，這表明腫瘤的發生與發展與機體免疫密切相關[21]。同時在正常情況下，機體Th1/Th2處于動態平衡，許多研究均證實腫瘤發生時免疫反應向Th2漂移，在進展期腫瘤病人外周血中IFN-γ分泌減少，IL-10分泌增加導致在腫瘤生長時，Th1/Th2向Th2漂移[22]。劉文立等研究發現白及多糖可以提高CT-26荷瘤小鼠外周血中CD4+T、CD 4+/CD8+T淋巴細胞的比值，降低CD8+T細胞的數量，從而降低CT-26荷瘤小鼠的腫瘤質量[23]。在本研究中駝乳源性復合益生菌高、低劑量組均可提高荷瘤小鼠脾臟中CD4+T細胞比例，消耗CD8+T細胞降低其所占比例，通過抑制CD8+T細胞調整CD 4+/CD8+T細胞平衡，并使荷瘤小鼠血清中Th1型細胞因子IL-2和IFN-γ含量升高(P＜0.01)，Th2型細胞因子IL-10含量降低(P＜0.05)，提示乳源性復合益生菌可以通過提高細胞免疫中T淋巴細胞亞群數量的變化，提高CD4+T、CD4+/CD8+T細胞的平衡，減少Tregs在腫瘤組織的浸潤，并逆轉Th1/Th2漂移，恢復Th1/Th2型細胞因子平衡，與既往研究結果一致。提示駝乳源性復合益生菌可能是通過細胞免疫途徑發揮抗腫瘤作用。

4 結論

綜上所述,4種駝乳源性具有免疫調節活性的復合益生菌具有減緩CT-26結腸癌荷瘤小鼠腫瘤生長的作用，具體的作用機制是通過提高荷瘤小鼠免疫為出發點，調整CD 4+/CD8+T淋巴細胞的平衡，改善Th1/Th2的亞群比例，從而提高荷瘤小鼠的抗腫瘤免疫抵御腫瘤,有望于臨床上應用于腫瘤患者的輔助治療。