同位素內標稀釋液質法測定嬰幼兒配方乳粉中維生素K1

公丕學，廉貞霞，王艷玲，薛霞，戴琨，劉桂亮，王駿，劉艷明，趙發

（1.山東省食品藥品檢驗研究院，山東省特殊醫學用途配方食品質量控制工程技術研究中心，山東省食品藥品安全檢測工程技術研究中心，濟南 250100；2.山東省藥學科學院，濟南 250100；3.方正縣產品質量綜合檢驗檢測中心，黑龍江 方正 150800）

0 引 言

維生素K1是一種脂溶性維生素，缺乏時會引起失血[1]，在臨床上被廣泛用于防治獲得性維生素K依賴性凝血因子缺乏癥[2]和新生兒自然出血癥[3-4]。生產嬰幼兒配方乳粉時需要適量添加。

檢測維生素K1的方法有毛細管電泳法[5-6]，分光光度法[7-8]，液相色譜-紫外法[9-12]，液相色譜-柱后衍生熒光法[13-15]。毛細管電泳法、分光光度法靈敏度低，準確度差；液相色譜-紫外法干擾嚴重，定量不準確；液相色譜熒光法流動相中使用二氯甲烷，對儀器損害大。液質法檢測速度快，靈敏度高，定性定量準確。

本文采用同位素稀釋內標UPLC-MS/MS法對嬰幼兒配方乳粉中維生素K1含量測定進行研究，通過加入內標提高了定量準確性，并對樣品前處理、色譜質譜條件進行優化，提高了檢測靈敏度、準確度。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ Quantiva超高效液相色譜串聯質譜聯用儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；配備HESI電離源、BSA822-cw型電子天平，德國Sartorios公司；AB204-S型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；MS3旋渦混合器，德國IKA公司；SB-800DTD型超聲波清洗器，中國寧波新芝生物科技股份有限公司；3-18K型冷凍離心機，德國Sigma公司；M illi-Q超純水儀器，美國M illipore公司；45位恒溫氮吹儀，美國Organomation公司；SW 22恒溫水浴振蕩器，德國優博萊公司。

維生素K1標準物質，德國Dr.Ehrenstorfer公司；脂肪酶（活力≥700 U/mg），德國sigma公司；甲醇（色譜純）,美國Fisher公司；正己烷（色譜純）,美國Merck公司；無水乙醇、氯化鈉（分析純）,國藥集團化學試劑有限公司；醋酸銨（色譜純），德國Flukar公司；色譜柱：BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7μm），美國Waters公司；0.22 μm有機微孔濾膜，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 標準溶液

1.2.1 維生素K1標準溶液校正

準確稱取維生素K1固體標準物質20.0 mg至燒杯中，用正己烷溶解，轉移至10 mL容量，并用正己烷定容至刻度。取200μL至25 mL容量瓶中，用正己烷定容，配置待校正維生素K1標準溶液，在248 nm下用紫外分光光度計進行校正（具體校正方法見國標[16]）。

1.2.2 標準工作曲線配制

準確稱取1 mg（精確至0.01 mg）維生素K1-D7同位素內標，用甲醇溶解轉移至10 mL容量瓶中用甲醇定容至刻度，配制成質量濃度為100 mg/L內標溶液。準確移取維生素K1校正儲備液，用甲醇配制系列標準工作液質量濃度分別為5，10，20，50，100，200，500μg/L；其中每個標準點含維生素K1-D7同位素內標質量濃度為50μg/L。

1.3 實驗條件

1.3.1 色譜條件

BEH C18色譜柱:100 mm×2.1 mm，1.7μm；流動相:A甲醇，B乙酸銨（含體積分數0.1%甲酸）；梯度洗脫程序：0～4.0 min，A由10%線性變化至90%，保持2.0 min，6.1 min時，A由90%變為10%，并保持1.9 min。流速為0.3 mL/min；柱溫為35℃；進樣量為5μL。

1.3.2 質譜條件

離子化模式為ESI+；鞘氣流速為13.3 L/min；輔助氣流速為4.0 L/min；電噴霧電壓為3 500 V；離子導管溫度為333℃；氣化溫度為317℃；碰撞氣壓力為0.266 Pa。維生素K1及同位素內標的離子對及錐孔電壓、碰撞電壓、駐留時間如表1所示。

表1 質譜參數優化

1.3.3 基質效應評價

在液相色譜串聯質譜定量檢測中，基質成分改變噴霧液滴張力和黏度，導致離子化程度不同，對目標物電離效率會產生影響，從而會使定量結果不準確，需要考察質譜方法的基質效應，以便選擇合適的定量方式。在經過處理后的樣品溶液中加入維生素K1內標，通過與維生素K1內標標準溶液進行比較，可以通過計算，定量評價目標物的基質效應。為考察維生素K1的基質效應，可以通過比較同位素內標在標準溶液和樣品處理液中響應值獲得。通過基質效應計算，即

式中：A為標準溶液中維生素K1內標的峰面積；B為樣品處理液中維生素K1內標的峰面積。在樣品處理液中加入與標準溶液相同濃度的維生素K1內標。如果通過計算基質效應約等于0%，說明沒有基質效應；如果基質效應大于0%，說明出現了離子抑制效應，即基質抑制；如果基質效應小于0%，說明出現了離子增強效應，即基質增強。

1.4 樣品處理程序

1.4.1 酶解樣品

稱取2.50 g乳粉樣品置于50 mL離心管中，加250μL維生素K1內標（質量濃度為1 mg/L），加入10 mL溫水分散溶解樣品，加入0.6 g脂肪酶，渦旋混勻后，在振蕩器中（37±1）℃下恒溫連續振蕩6 h，待試樣酶解完全。

1.4.2 提取目標物

取出試樣放置至室溫后，加入10 mL乙醇，渦旋混勻，加1 g碳酸鉀，充分混合均勻后，再加10 mL正己烷振蕩5 min，轉速為8 000 r/min高速離心后，取上層溶液至另一離心管中，再用10 mL正己烷重復振蕩提取一次，合并兩次上層提取液。向其中加入10 mL飽和氯化鈉溶液，渦旋5 min，充分混勻，靜置分層后，取全部上層溶液至離心管中，氮吹，用移液槍準確加1 m L甲醇，渦旋超聲，復溶后，過有機濾膜，濾液待上機測定。

2 結果與討論

2.1 實驗條件考察

2.1.1 酶解條件的優化

維生素K1屬于脂溶性維生素，而乳粉中含有大量脂肪，因此維生素K1與乳粉中脂溶性物質形成結合態，很難被直接提取。通過使用脂肪酶酶解樣品中脂肪使其降解生產不飽和脂肪酸，維生素K1成為游離態，容易從樣品溶液中提取。考察了不同脂肪酶用量以及酶解時間對樣品的提取效率。脂肪酶用量根據樣品中脂肪含量不同而有所不同，脂肪酶用量結果如圖1所示，經過多次實驗，脂肪酶使用量為0.6 g時，提取效率能達到90%以上，滿足實驗要求，低于0.6 g時，提取效率低于80%，說明樣品中脂肪不能被脂肪酶酶解完全，仍然存在結合態，導致提取充分，提取效率低。

圖1 脂肪酶用量對提取效率的影響

脂肪酶在降解樣品中脂肪時，需要足夠的反應時間，酶解時間結果如圖2所示。當酶解時間達到6 h時，提取效率能夠達到90%以上；低于6 h時，提取效率不足80%，可能是因為脂肪酶與脂肪在發生反應時，至少需要6 h以上才能反應完全。因此最終選擇0.6 g脂肪酶，酶解6 h作為最佳酶解條件。

圖2 酶解時間的優化

2.1.2 皂化條件的優化

皂化是通過用堿使酶解后的脂肪生成能溶于水相的脂肪酸鹽，因此堿的加入量會影響目標物的提取效率。堿量不足則會導致皂化反應不完全，萃取時乳化嚴重，分層不明顯，部分脂溶性維生素K1可能分散在乳化層中，導致提取效率降低；堿量過多則會和維生素K1反應，提取效率降低，同時導致測定結果偏低。實驗考察了NaOH溶液和固體K2CO3兩種堿對提取效率的影響，結果顯示當使用NaOH溶液（濃度為10 mol/L，2 mL）時提取效率低于70%，推測可能是堿過量導致與樣品溶液中維生素K1發生反應；K2CO3（1 g）提取效率能達到90%，說明堿量適合，因此皂化時選擇加入1 g的K2CO3。

2.1.3 基質效應評價結果分析

嬰幼兒配方乳粉中含有添加的維生素K1，因此使用基質加標或外標的方式評價不同樣品的基質效應會存在較大差異，評價結果準確性差，樣品中不含有維生素K1的同位素內標，使用同位素內標進行基質效應評價更能反應方法的準確性和可靠性。在樣品處理液中加入與標準溶液相同濃度的同位素內標標準物質。如果基質效應約等于0%，說明幾乎不存在基質效應；如果基質效應大于0%，說明樣品中產生了離子抑制效應，即基質抑制；如果基質效應小于0%，說明樣品中產生了離子增強效應，即基質增強。

通過1.3.3基質效應計算同位素內標在嬰幼兒配方乳粉中的基質效應，質量濃度為50μg/L維生素K1內標基質效應在52%～74%，則說明樣品對維生素K1內標有較強抑制作用，標準溶液定量樣品含量偏差較大，該定量方式不適合選擇標準溶液外標法。因此選擇定量方式為同位素內標法定量，更準確，該方法能夠對乳粉中維生素K1準確定量。

2.1.4 色譜條件的優化

色譜使用流動相的酸堿性對目標化合物的離子化效率有影響，也可以改善色譜峰峰形，在本試驗中比較了中性流動相甲醇-水和酸性流動相甲醇（含體積分數0.1%甲酸）兩種流動相體系。由于實驗中維生素K1采用電噴霧電離正離子模式的檢測，流動相中含有提供質子的酸能夠提高維生素K1離子化效率，增強信號強度。在BEH C18色譜柱上分離試樣，流動相甲醇-10 mmol/L乙酸銨（含體積分數0.1%甲酸）目標物峰形較好，質譜信號強度增強，靈敏度提高，因此選取甲醇-10 mmol/L乙酸銨（含體積分數0.1%甲酸）作為流動相。

2.1.5 質譜條件的優化

將質量濃度為100μg/L的維生素K1和維生素K1-D7同位素內標標準溶液通過蠕動泵進入質譜儀，在ESI+模式下對目標物母離子分別進行掃描，確定目標物的準分子離子峰為[M+H]+，維生素K1及維生素K1-D7的母離子m/z分別為451.426和458.457；調節離子源參數后做子離子掃描，同時對子離子進行碰撞能等質譜參數優化，選擇離子豐度較高的兩對子離子，其中以豐度相對較高的子離子作為定量離子，豐度相對較低的子離子作為定性離子。維生素K1MRM色譜如圖3所示；維生素K1-D7內標標準溶液的MRM色譜如圖4所示。

圖3 維生素K1標準溶液的MRM色譜

圖4 維生素K1內標標準溶液的MRM色譜

2.2 方法學考察

2.2.1 線性范圍與檢出限

將系列標準工作曲線溶液分別進樣5μL，以定量離子峰面積與同位素內標定量離子峰面積比值為縱坐標，以維生素K1標準溶液質量濃度（μg/L）為橫坐標，繪制標準工作曲線，得出線性回歸方程為y=0.02447x+0.00629，線性相關系數0.9998，以信號與噪音比值S/N≥3作為檢出限，計算檢出限為1 ng/g，以信號與噪音比值S/N≥10作為定量限，計算定量限為2 ng/g。

2.2.2 方法回收率和精密度

采用嬰幼兒配方乳粉樣品，進行實驗。分別添加質量分數為10、50和100 ng/g 3個水平，按照步驟1.4進行處理和測定，具體實驗結果見表2所示。

表2 添加回收率與精密度(n=6) ng/g

由表2可見，維生素K1的回收率在88.0%～102.5%。不同水平加標樣品樣品重復測定6次，測定結果表明RSD為1.75%～5.26%。結果表明，該方法能夠滿足實際樣品的檢測需要。

2.2.3 實際樣品測定

使用所建立的方法，對市售25批次嬰幼兒配方乳粉進行檢測，結果均符合明示值。通過購買美國NIST SRM 1849a嬰兒/成人營養配方標準品（標注值為1.06±0.17μg/g），按照步驟1.4同時進行6批樣品平行處理，測定結果見表3所示，平均值為1.04μg/g，在0.95～1.12μg/g范圍內，RSD為6.02%，所建立的方法測定結果符合標準質控樣品真值。

表3 營養配方標準品測定結果 μg/g

3 結論

使用脂肪酶對乳粉樣品酶解，皂化，正己烷提取，飽和氯化鈉水洗，濃縮，內標法定量，能夠高效提取樣品中維生素K1，能夠提高方法的靈敏度及準確度。通過對酶解條件進行優化，堿種類選擇，并對色譜條件和質譜參數進行了優化，建立了檢測嬰幼兒配方乳粉中維生素K1的同位素內標稀釋超高效液相色譜串聯質譜方法。

本方法具有線性范圍寬，檢出限低，靈敏度高，定性、定量準確等優勢，維生素K1的加標回收率在88.0%～102.5%，重現性好，適用于嬰幼兒配方乳粉中維生素K1的定量檢測。本方法能夠為生產企業和檢驗機構檢驗嬰幼兒配方乳粉中維生素K1含量提供技術支持。