堿基編輯器新載體安全又高效

編譯 希區客

如果你是一個航天發燒友，同時又緊跟CRISPR的動態，那么你或許會把這兩個領域的新晉“頂流”——火星登陸的毅力號和體內注射的堿基編輯——組成“CP”，因為它倆從某種層面上看是非常相像的。

毅力號探測器乘坐火箭升空，之后依靠自身的巡航、下降和減速系統完成火星軟著陸，隨即開始在目標區域活動，并借助多種相機、分析儀、成像儀、光譜儀等裝備尋找生命的跡象。CRISPR系統通過注射進入機體，之后靠著遞送載體保駕護航行至目標細胞，載體隨即釋放堿基編輯工具，細胞內的基因編輯工作由此開始。

對于毅力號來說，從時速2萬公里變為0的著陸過程是極具挑戰性的“恐怖7分鐘”。而對于基因/堿基編輯系統而言，從進入生物體到開始編輯的整個過程都是不可見又不可控的“恐怖時間”。

火星登陸成不成，仰仗著陸系統的能耐；堿基編輯好不好，指望遞送載體的水平。如果我們想讓體內注射形式的基因治療真正發揮作用，設計出更智能、更高效的遞送載體是關鍵。

近期，由劉如謙（David Liu）博士領導的哈佛團隊推出了新一代（第四代）的“工程化類病毒顆粒”載體（eVLP）。該團隊于2022年1月發表在《細胞》（Cell）上的研究顯示，這些氣泡狀的eVLP能將CRISPR和堿基編輯組件傳送至各類器官和組織。相比于前三代載體，新版eVLP以更高的效率抵達目標，釋放組件，編輯細胞，且副作用極小。（所謂“類病毒顆粒”是病毒蛋白的組裝體不具備病毒的遺傳物質，換言之，eVLP載體只擁有病毒的軀殼，卻沒有病毒的靈魂。）

新成果包含了3個關鍵的概念驗證試驗：研究團隊借助有eVLP加持的堿基編輯系統，成功恢復了遺傳性失明小鼠的視力，關閉了小鼠肝臟中與高膽固醇水平相關的突變基因，修復了小鼠大腦內的缺陷基因。

第四代eVLP如同一艘功能強勁的分子飛船，載著基因修改器，駕輕就熟地進入視網膜組織，失明小鼠在完成單次注射后的短短5周內就獲得了視力。小鼠的肝臟和大腦組織存在防御屏障，尤其大腦的屏障非常牢固，但eVLP還是攻堅成功，準確送達——單次注射降低了肝臟突變基因導致心臟和神經損傷的風險，而進入腦細胞的編輯工具有大約50%的機會改變缺陷基因。

更令人贊嘆的是，eVLP是一個“即插即用”的平臺：通過改變目標組件，理論上它可以抵達身體的任何地方。

劉如謙指出：“我們非常需要一種更好的方法來將蛋白質輸送到生命體的各種組織中。我們希望這些eVLP不僅能用于傳遞堿基編輯工具，還可運載其他的蛋白質。”

生物技術公司Verve Therapeutics的聯合創始人兼首席執行官塞卡·凱瑟瑞桑（Sekar Kathiresan）博士表示：“總的來說，劉博士及其同事在基因編輯工具的遞送方面取得了令人激動的新進展。”（凱瑟瑞桑并未參與新研究。）

堿基編輯器-遞送載體復合物的結構示意圖

智能運送官

我們已經擁有一系列出色的基因編輯器，但一直缺少高效的運送者。

所謂的堿基編輯是CRISPR的一種變體，以其極致的精確性而風靡行業。與傳統的CRISPR類似，堿基編輯工具有兩大組成部分：負責尋找目標基因的向導RNA，以及負責替換單個堿基（A、G、C、T）的Cas蛋白。不過堿基編輯不像Cas9“魔剪”那般剪斷DNA雙鏈，因此它更少犯錯，有望成為治療數百種遺傳疾病的終極方案。

病毒長期以來都是研究人員首選的遞送載體，因為它們具有感染細胞的能力。科學家會消除病毒引發疾病的能力，與此同時，又利用它攜帶堿基編輯器的編碼序列的本領。載體一旦進入細胞，其中的編碼序列就會表達蛋白質。細胞因此能夠產生自己的堿基編輯工具。劉如謙團隊和其他科學家此前都利用過腺相關病毒（AAE）將編碼堿基編輯器的DNA遞送至靶組織。

研究團隊利用eVLP將體內基因治療工具包送往小鼠的視網膜、肝臟和大腦

但這種方式并非最佳。一方面，我們知道堿基編輯器的核心功能部件是負責轉化堿基（C→U）的脫氨酶，以及能與目標DNA結合的Cas蛋白。將這些蛋白質以DNA序列的形式導入目標然后再表達繼而開展編輯（借助核轉染技術），整個過程更加漫長，增加了脫靶頻率。另一方面，病毒載體雖然高效，但會導致細胞超速運轉，產生過多堿基編輯器，加重細胞負擔，帶來副作用。此外，病毒也有可能通過進入基因組本身而破壞基因完整性，引發癌癥風險。

鑒于上述種種，我們是不是可以設計出一類取病毒之精華而去病毒之糟粕的“仿”病毒載體，直接帶著堿基編輯器而非其編碼序列，奔赴目的地呢？

新eVLP，新世界

只有病毒軀殼而沒有病毒DNA的eVLP就是這一思路下的典范作品。它不會造成真正的感染，卻又能像真病毒一樣快速有效地“感染”細胞，且裝載的是編輯工具，沒有細胞內“再表達”環節。

當然，它也存在不足之處，那就是遞送精準度很糟糕：舊版本（前三代）的eVLP有時候會像一艘歸航系統失控的飛船，撞向其他行星并引發意想不到的災難；它也不擅長“到點卸貨”，編輯器有時明明已經抵達目的地了，卻被鎖在載體內無法釋放，這讓整個基因編輯工作失去了意義。

而劉如謙等人所做的工作就是彌補老eVLP的短板。他們分析發現，如果限制在eVLP內充當載體“安全帶”的蛋白質的數量，“貨物”會更容易被釋放；此外，貨物的包裝方式也會影響其釋放。安全帶和貨物之間的平衡似乎是既保證貨物安全又能助其在目的地順利釋放的關鍵。另一方面，在eVLP的外層修飾特定的蛋白質有助于它抵達目標器官。

劉如謙表示：“我們知道了一些eVLP的關鍵瓶頸，以及解決它們的方法。雖然我們必須為一種不尋常的蛋白質貨物開發新版本的eVLP載體，但是我們可以高效地完成這項工作。”

工作的成果是喜人的，新載體所能包裝的貨物量是老版eVLP的16倍，新工具的編輯效率比過去提高了26倍。

如研究團隊事先所預期的，四代eVLP幾乎不受脫靶效應的困擾。他們檢測了DNA水平和RNA水平的脫靶情況，發現eVLP相比于病毒或其他質粒載體，幾乎不會發生脫靶現象。

劉如謙團隊計劃未來開發更優質的“安全帶”蛋白質，為載體內的“貨物”提供更好的服務。這些貨物可以是基因編輯器，也可以是胰島素或用于癌癥免疫治療的蛋白質等。此外，他們還將進一步解析 eVLP，探索它在人體內的更多可能，并嘗試研發更新型的載體。

資料來源singularityhub.com