大麻二酚制備的研究進展

周靜瑩 張偉

【摘 要】 大麻二酚（Cannabidiol，CBD）是從大麻屬植物中分離得到的單體，具有廣泛的藥理作用且沒有成癮性，越來越受藥物學家的關注。文章就CBD的植物提取、化學合成、生物合成等制備研究進展進行概括和歸納，以便為CBD制備提供參考。CBD植物提取方法主要有熱回流提取法、超臨界流體萃取法、超聲輔助溶劑法等。化學全合成主要是以2，4-二羥基-6-戊烷基苯甲酸甲酯為原料，在氫氧化鉀催化下經過一系列化學反應，重結晶得到CBD;化學半合成主要是把大麻二酚酸（Cannabidiol Acid，CBD-A）脫羧后轉變為CBD。生物合成主要是以己酰輔酶A（hexanoyl-CoA）及其他關鍵催化酶的作用下生成CBD。

【關鍵詞】 大麻二酚;提取;分離純化;合成

【中圖分類號】R285?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2022）02-0072-08

Research Progress in the Preparation of Cannabidiol

ZHOU Jingying1 ZHANG Wei2*

1.School of Pharmaceutical Science & Yunnan Key Laboratory of Pharmacology for

Natural Products， Kunming Medical University，Kunming 650500，Chian;

2.Kunming? Longjin Pharmaceutical CO.，LTD， Kunming 650503，Chian

Abstract：Cannabidiol （CBD） is a monomer isolated from cannabis plants， which has been paid more and more attention by pharmacologists because of its wide range of pharmacological effects and no addiction. In this paper， the research progress of plant extraction， chemical synthesis and biosynthesis of CBD is summarized and summarized in order to provide a reference for CBD preparation. CBD plant extraction methods mainly include hot reflux extraction， supercritical fluid extraction， ultrasound-assisted solvent extraction and so on. The total synthesis of CBD is mainly based on the recrystallization of 2，4-dihydroxy-6-pentanyl methyl benzoate through a series of chemical reactions catalyzed by potassium hydroxide， and the semi-synthesis of CBD is mainly based on the decarboxylation of cannabidiol acid （CBD-A） to CBD. Biosynthesis is mainly to generate CBD by the action of hexanoyl-CoA and other key catalytic enzymes.

Key words：Cannabidiol;Extraction;Purification;Synthesis

大麻（Cannabis Sativa.L.）屬一年生草本植物，其莖、花、葉和種子等均具有實用價值，用途十分廣泛，大麻及其制品曾廣泛應用于人們的生產生活當中[1]。工業大麻是指毒品活性成分四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）干重含量<0.3%的大麻，THC干重含量>0.3%的則稱為藥用和毒品大麻 （marijuana & hashish）。相關法律規定，THC含量低于0.3%的大麻品種可以種植。目前，我國大麻的生產加工重點已經逐步轉向從大麻植物中提取大麻素（CBD），對產品進行深加工，并將其綜合開發利用[2]。

大麻二酚是從大麻屬植物中分離得到的一種單體，它與四氫大麻酚是同分異構體。THC具有致幻成癮性，故CBD在一定程度上能抑制這種致幻成癮性，其結構如下：

研究[3]證實，CBD可治療自身免疫性疾病、神經系統疾病、代謝綜合征、神經精神疾病在內的一系列疾病。英國GW公司已研發出以CBD為主要成分的Sativex和Epidiolex藥物，用于治療癲癇和多發性硬化癥（MS）[4]。同時，CBD具有鎮靜、改善睡眠質量、抗氧化、抗炎、抗痤瘡等作用，其應用領域日益廣泛，下游產品也不斷增加。

1 提取工藝

1.1 酶法提取 酶具有水解作用，能將植物的細胞壁進行破碎，從而使物料中的活性成分、色素等更易被溶劑萃取出來。因此，酶輔助溶劑法可以明顯提高工業大麻的提取率[5]。

吳俊鋒等[5]人研究了酶輔助溶劑萃取法工藝，分析其前處理方式、酶的種類含量以及酶解時間、液料比、萃取時間等影響因素并改良實驗條件，最終確定實驗的最佳條件為：將大麻葉在100 ℃的烘箱中加熱2 h;用復合植物水解酶（Viscozyme L）和酸性蛋白酶的復合物進行酶解，用量為物料的0.5%，酶解1 h后加入萃取劑正己烷，1000 r/min快速攪拌3 h，將上層的正己烷進行分離，置旋轉蒸發儀中，蒸干后去除溶劑，得油狀物。按1∶5加入甲醇，零下40 ℃放置1 h，零下6 ℃離心后取出上層清液，加入油狀物 10% 的活性炭脫色30 min，過濾，濾液旋蒸后即得富含CBD的浸膏。此條件下浸膏得率達到5.40%，CBD的含量為56.11 mg/g。

趙平嶺[6]將工業大麻葉干燥粉碎，按1∶10（g/mL）的比例加入纖維素酶和果膠酶混合液，加入的酶量為相對于工業大麻葉質量濃度的0.5%，搖床內水解后加入正己烷作為萃取劑，攪拌，萃取;取上層清液置旋轉蒸發儀中，蒸干，得到油狀物;在油狀物中油狀物/甲醇1∶5比例加入甲醇，于零下40 ℃條件下下靜置1 h，靜置完畢后離心取上清液，在上清液中加入相對油狀物10%質量的活性炭脫色30 min，脫色后過濾，將所得濾液二次旋蒸，旋蒸后產物加入氯仿溶解，有機膜過濾后即可獲得CBD溶液。

曹亮等[7]通過對纖維素酶、木質素降解酶、半纖維素酶混合含量和比例的實驗及分析，得到較高的CBD的提取率。其工藝為：將工業大麻花葉部分于55～60 ℃ 條件下烘干，粉碎，過120～200目篩，得工業大麻粉。將工業大麻粉末的含水量調至18%～20%，在溫度為65～75 ℃，螺桿轉速80～120 r/min，膜孔孔徑10～30 mm條件下進行擠壓膨化，得膨化產物。加水溶解調節溫度至35～45℃，pH2.5～4.5，加入纖維素酶、木質素降解酶、半纖維素酶混合酶解，其比例為5∶2∶（1-3），總添加量為0.1%～0.25%。向酶解液中加入石油醚、乙醚、正己烷中一種或多種混合物，浸提，用三相分離機分離得到水相、殘渣及有機相。用超濾膜（0.001～0.01μm） 濃縮有機相，得到富含CBD的浸膏，CBD的提取率可達92.31%～96.96%。

張翼等[8]將火麻葉在100 ℃條件下烘干2 h，冷卻，按1 mL/g加入纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶中的一種或幾種，搖床內水解1 h。向水解液中加入正己烷作為萃取劑，1000 r/min 攪拌均勻，分離，得上清液，蒸干得油狀物。加入其體積量為油狀物5倍的甲醇，-40 ℃靜置1 h，-6 ℃進行離心。取上清液加入活性炭脫色 30 min，過濾，取濾液置旋轉蒸發儀中，蒸干，即得富含CBD的浸膏。

姚德坤等[9]使用的是內、外切葡聚糖酶和纖維素酶。將新鮮大麻根部、莖部或葉子部位切成2～3 cm左右的小段，干燥1.5～2 h，將干燥后的小段研磨粉碎，過20～40目篩，按料液比1∶5加入酶濃度為0.5 ‰～1.5‰的內、外切葡聚糖酶和纖維素酶，其體積比為1∶1∶1，調節pH至4.5，在40～50 ℃條件下，酶解1～2 h。以75%～95%乙醇為溶劑，200～500 W 微波提取5～10 min，過濾，濃縮得CBD粗提物。加入60%乙醇（其比例為1∶3）于高壓處理袋中，在400 MPa條件下，加壓提取20～30 min。過濾，重復提取2次，將濾液濃縮，即得膏狀物。將膏狀物上硅膠層析柱，用乙酸乙酯：氯仿 =5∶1至7∶1洗脫，收集洗脫液真空干燥后得CBD，回收率達90%以上。

1.2 超臨界流體提取法 超臨界CO2是一種介于氣體和液體中間狀態的物質，它不僅具有液體的流動性，能萃取某些脂溶性物質;還具有與氣體相似的擴散性，超臨界CO2萃取技術就是利用這一特性發展而來。這種萃取方法通常需要使用專門的具有三個腔室的“閉環萃取器”完成。

朱元莊[10]將火麻植物的花葉采摘后，在70～100 ℃下干燥 2～3 h，粉碎，采用亞臨界萃取裝置進行萃取，以20%～40%乙醇為夾帶劑，萃取裝置溶劑為正丁烷、乙醇或兩者不定比例的混合物，用量為花葉質量的5～8倍，萃取溫度35～45 ℃，壓力0.4～0.6 MPa，萃取時間40～60 min。通過上述操作可得到富含大麻二酚的粗浸膏，將粗浸膏溶于乙醇溶液（乙醇用量為粗浸膏的5～10倍）后低溫冬化處理，溫度為 -10 ℃～40 ℃，時間45～60 min，將低溫處理后的溶液進行離心（4500～6000 r/min離心20～30 min）或過濾。取上清液，加入活性炭（用量為粗浸膏質量的6%～10%）進行脫色，旋轉蒸發除去乙醇，可得富含CBD 的火麻浸膏。

項偉等[11]將大麻花葉在 120 ℃條件下干燥 0.5～4 h，粉碎至50目以上，在30～55 ℃、13～30 MPa 條件下采用CO2超臨界萃取1～9 h（采用濕法，上樣前先用 1BV 的磷酸緩沖液進行柱平衡，再用 2BV 10% 的乙醇溶液進行柱平衡），回收CO2，得大麻花葉的初提物。將初提物溶解于10倍體積的乙醇或甲醇中，精細過濾除去雜質，蒸干溶劑后備用。再上苯乙烯大孔吸附樹脂或層析硅膠，用不同梯度濃度的乙醇洗脫（濃度分別為25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%），收集洗脫液，蒸干后得CBD粗品。在此工藝技術條件下，不僅提高了CBD的含量，同時也降低了THC的含量。

高寶昌等[12]將漢麻成熟期的花葉在自然條件下晾干或在30～60 ℃條件下烘干1～4 h去除水分，粉碎，用超臨界CO2萃取CBD，在45 ℃，壓力30 MPa條件下萃取3 h，得到大麻二酚浸膏。將大麻二酚浸膏溶解于無水乙醇，離心處理并收集上清液，加入大孔吸附樹脂（NKA-Ⅱ、H-103、DM-130、X-5、D101 的一種或幾種）中，在25 ℃下震蕩12 h，用60%乙醇洗脫。重復以上步驟，濃縮后得大麻二酚濃縮液。將濃縮液裝入硅膠分離柱，以石油醚/乙酸乙酯比例95∶5進行洗脫，收集CBD餾分，減壓濃縮后得CBD純化液。

孫川[13]取工業大麻的花、葉子、麻糠（去除麻籽）中的一種或幾種作為原料，將其粉碎至40～100目，然后在80～160 ℃下干燥 0.5～1 h，再將粉碎原料進行超臨界CO2萃取，其萃取溫度為30～50 ℃，壓力10～30 MPa，萃取1～4 h得大麻二酚初提浸膏。將初提浸膏加熱至40～100 ℃，分子蒸餾（加熱溫度80～200 ℃，真空度1.33～1999.8 Pa）得CBD富集物。最后。以大孔樹脂或 MCI 樹脂（或 C18 硅膠）為固定相，超臨界CO2為流動相，乙醇為夾帶劑，超臨界二氧化碳和乙醇質量比為85∶15至98∶2，分離純化，得到無THC且純度大于99%的CBD。

1.3 超聲輔助溶劑法提取 將有機溶劑作為提取溶劑加入到大麻植物原料中，在超聲條件下混合數分鐘，可以使大麻素等轉移到有機溶劑中，對大麻酚類物質進行提取。

高寶昌等[14]為了確定超聲輔助溶劑法提取大麻二酚的最佳條件，考察了該提取方法中多種因素對提取率的影響，最終確定最優條件為：以無水甲醇作為提取溶劑，超聲時間15 min，料液比為1∶20，提取次數為3次。該方法操作簡單且高效、提取完全。將提取物上ODS柱，以甲醇∶水=78∶22為流動相進行等度洗脫，分離出大麻二酚。

趙立寧等[15]將大麻植株干燥后粉碎后，溶于正己烷-乙酸乙酯 （v/v=9∶1） 的混合溶劑中進行超聲提取，按提取液：KOH溶液（質量分數為5%或10%）=5∶1體積比混合，萃取靜置后得到上、中、下三層分別為有機相、沉淀相和水相，上下兩層均含有CBD。將上層有機相在60 ℃條件下旋干2～3 min，下層水相在80 ℃條件下旋干10～20 min后得到固體，水洗即得CBD。該方法簡單，易于實現工業化，且目標產物的純度可達84%～90%，富集率可達80%。

時圣巖[16]將從大麻花葉中提取的粗品溶于水或乙腈中，經超聲、過濾后，取其濾液。將濾液泵入以十八烷基鍵合硅膠為固定相，以乙腈和水的混合溶液（乙腈和水的體積比為 20∶80至40∶60）為流動相的動態軸向壓縮柱進行分離，利用紫外檢測器在220 nm檢測，并收集保留時間在155～240 min的餾分，該餾分就是CBD。將收集到的餾分進行減壓旋蒸濃縮，冷卻干燥后經HPLC分析，CBD純度高達 99%。

1.4 熱回流提取法提取 將有機溶劑作為提取溶劑加入到大麻植物中，熱回流數小時，使大麻中部分成分轉移到有機溶劑中，從而對大麻植物中的活性物質進行提取。

王昆華等[17]將大麻粉碎，用60%～70%乙醇溶液回流提取2～3次，第一次提取加樣品質量7～8倍體積的乙醇溶液，后兩次可加5～6倍質量體積的乙醇溶液，每次提取時間均為1.5～2.5 h，合并提取液并進行濃縮，即得流浸膏。加入流浸膏體積2～3倍的水，再用NaOH、三乙胺、氨水或三乙醇胺水溶液等堿性溶劑調pH=11～12，回流提取2～3次。棄濾渣，合并濾液，再加稀HCL調pH=7，再加入等體積的氯仿-石油醚（v/v=1∶1-1∶2）萃取3～4次，將CBD萃取到有機相中，回收有機溶劑得大麻二酚粗膏。加入20%～30%乙醇，過聚酰胺柱，依次用純凈水、40%～50%乙醇、70%～80%乙醇洗脫，收集含大麻二酚洗脫液，濃縮后得聚酰胺層析大麻二酚濃縮物。再上氧化鋁柱，依次用體積比為1∶3的氯仿-石油醚和體積比為8∶1∶1或10∶0.5∶2的氯仿-甲醇-四氫呋喃洗脫，收集含CBD的洗脫液進行濃縮得CBD粗品。甲醇溶解所得CBD粗品，過氨基鍵合硅膠柱（氰基鍵合硅膠柱或苯基鍵合硅膠柱），加壓后進行柱層析。首先，用20%甲醇平衡、40%～50%甲醇洗脫2～3個體積柱后，用65%～70%甲醇洗脫，將收集含CBD的洗脫液濃縮。最后，濃縮物用丙酮溶解，加入冰醋酸，結晶、過濾，低溫干燥得CBD。運用此方法得到的產品純度高，可達98%，回收率高，可用于工業化推廣。

欒云鵬[18]以工業大麻為原料，干燥后粉碎至花葉粗粉，將粗粉加入3～10倍體積無水乙醇、95%乙醇、石油醚中的一種或幾種，60～80 ℃條件下熱回流，每次回流提取1～3 h，提取2～3次。合并提取液，濃縮，得工業大麻流浸膏。將流浸膏進行大孔樹脂層析（大孔樹脂包括D101型、AB-8型、XAD-2型等），依次用30%～40%、60%～80%的乙醇洗脫，合并含大麻二酚部分洗脫液，濃縮后得大麻二酚富集物。將富集物進行正相硅膠柱層析，以石油醚：二氯甲烷=（4～15）∶1洗脫，合并含大麻二酚的洗脫液，減壓濃縮干燥，得大麻二酚純品。

高哲等[19]以大麻葉進行熱回流法提取CBD，并對其提取工藝進行了優化。通過單因素試驗和正交試驗分析得出CBD熱回流法的最佳提取工藝條件為：火麻葉在60 ℃下烘干至恒重，粉碎過20目篩，以正己烷作為提取溶劑，其料液比為1∶15，在80 ℃下提取3 h，然后冷卻，抽濾，旋蒸濃縮得浸膏。優化后此工藝浸膏得率為5.24%，浸膏中CBD的含量為46.16 mg/g。

1.5 分子蒸餾純化 普通蒸餾和精餾的原理是利用混合物物料體系沸點差來實現液體混合物的分離，其氣體與液體一直處于平衡狀態。而分子蒸餾是一種特殊的非平衡態蒸餾，它依賴于不同物質平均自由程的差異，可遠離沸點操作大幅度節約能耗，同時減少熱敏物質的熱損傷避免物質分解或聚合。分子蒸餾相較于普通蒸餾相對揮發度更高，更容易實現物質分離，在高真空度下工作時，能有效脫色并去除溶劑、有害金屬和化學殘留物，在提純物質等方面更具優勢。因此，采用分子蒸餾法對超臨界CO2萃取所獲得的大麻二酚粗提物進行富集和分離純化，富集大麻二酚后樣品的純度可達80%[20]。

1.6 樹脂吸附法純化 工業色譜柱是利用普通液相色譜分離原理設計工業色譜柱設備系統，并根據原料分離純化要求從混合物中提取純物質，它能夠將分子蒸餾得到的CBD產品純度進一步提高。它在大口徑液相色譜柱和大流量進樣系統基礎上，采用DDS系統多項因素進行優化以達到良好的分離效果，相較于傳統柱層析設備其自動化程度、分離效率和生產能力都得到了大幅提升。采用該方法對大麻二酚富集物進行分離純化時，可以通過調整其工藝參數以獲得不同品質的CBD產品，也可獲得純度 99%以上的精品CBD產品[20]。當然，設備目前的主要缺點在于其投資較高，不利于大規模進行生產。

2 化學合成

2.1 全合成法 合成大麻二酚最經典是Mechoulam報道[21]的方法，該法的原理是在三氟化硼的催化下，用1，3-二羥基-5-戊基苯和對薄荷-2，8-二烯-1-醇縮合得到CBD，具體如下為：

此方法原料易得，反應簡單，故而該方法一直被視作提取CBD產品的經典方法并在較長一段時間內沿用。但該反應體系復雜，有較多異構體和二聚體，后處理麻煩，需要柱層析純化且收率較低，不宜于放大生產。

陳劍戈等[22]以2，4-二羥基-6-戊烷基苯甲酸甲酯為原料，在氫氧化鉀催化下與N，N-二烷基醇胺進行酯交換后與（1S，4R）-1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）-2-環己烯-1-醇在Lewis酸催化下發生偶聯反應，經酸堿萃取和重結晶后得到高純度關鍵中間體產品，最后經過水解脫羧獲得粗品大麻二酚。該方法得到的粗品經過一次重結晶即可得到符合原料藥質量要求的大麻二酚，并且制得CBD純度可達99.88%～99.98%。同時此方法原料及試劑價格低廉，商業獲得方式簡單，總產率最高可達35%～40%，工藝明顯提高。合成路線如下：

Zachary P.Shultz等[23]以1，3-二羥基-5-戊基苯為原料，通過一系列化學反應得到CBD，合成路線如下圖所示：

2.2 半合成法

文獻報道[24]，將食品級氧化物（如ZnO，MgO，CaO或鹽、Na2SO4）與粉狀大麻生物質混后加熱至60 ℃至7 5℃，幾天時間大多數大麻生物質中的CBD-A將會轉化為CBD。同時，如果將這些試劑加入到CO2大麻提取物中加熱至約50 ℃，24 h左右即可完成脫羧。如果將大麻提取物與水、MgSO4和少量苛性堿混合，該混合物75 ℃條件下加熱后可在2小時內進行脫羧，轉化為大麻二酚。

大麻素類主要的化學形式為大麻酚和大麻酚酸，新鮮大麻組織中大麻素均以酸的形式存在;大麻植株及其提取物在干燥、陳化、加熱或焚燒后，大麻酚酸通過非酶促反應脫羧基轉化為大麻酚[25] 。

3 生物合成

我國對于大麻的種植已經有幾千年的歷史，但至今才探索出大麻素的生物合成途徑（圖1）。大麻素的生物合成依賴于聚酮化合物[26]和脫氧木酮糖-5-磷酸/2-甲基赤蘚醇磷酸（DOXP/MEP）[27]。這種著聚酮化合物由聚酮合酶（polyketide synthase， PKS）在催化條件下生成，并在生物體中廣泛存在。大麻植株中的聚酮合酶首先催化己酰輔酶A（hexanoyl-CoA），隨后與酶活性位點結合，經丙二酰輔酶A（malonyl-CoA）的一系列脫羧縮合后聚酮鏈延長，酶中間產物閉環并芳構化形成聚酮化合物——戊基二羥基苯酸（olivetolic acid， OLA），它也是大麻素合成的起始底物。DOXP/MEP途徑產生的異戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）在合成酶作用下生成焦磷酸香葉酯（geranyl pyrophosphate，GPP）;在異戊烯轉移酶（prenyltransferase）作用下，OLA既可以接受GPP也可接受GPP的異構體焦磷酸橙花酯（neryl pyrophosphate，NPP），分別形成以下兩種單萜類化合物：大麻萜酚酸（CBGA）和大麻酚酸（CBNRA）[28]。同時，由于GPP的活性遠大于NPP，因此大麻植株中CBGA含量遠大于CBNRA[29]。

CBGA是THCA、CBDA、CBCA三種合成酶的共同底物[30-33]，經氧化還原后分別形成THCA、CBDA和CBCA（圖1）。Sirikantaramas等人[34]對THCA和CBDA兩種合成酶分別進行深入研究后，發現兩種酶在功能和結構上具有很高的相似性。兩者的相似之處在于其催化反應過程都需要在氧分子的參與下結合FAD，同時釋放H2O2。二者的區別在于質子的轉移方法，THCA合成酶與CBDA合成酶二者分別從羥基和末端甲基上轉移1個質子，通過空間閉合環化形成THCA和CBDA。

加州大學Jay Keasling課題組羅小舟博士等[35]闡述了CBD生物合成的相關研究。通過酵母菌進行基因改造，將植物體內表達CBD相關的基因片段倒入酵母菌，實現了大麻素的生物全合成。該研究以半乳糖為起始材料，對酵母自身的甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway）進行改造，引入一條合成己酰輔酶A（hexanoyl-CoA）的代謝途徑，在多種不同的外源基因及催化酶的作用下，在酵母中完成大麻素生物合成途徑的異源重構，實現了包括CBGA、THCA、CBDA等多種主要大麻素及其衍生物的生物全合成。這個代謝途徑如圖2。

4 結語

CBD提取技術在較低成本上盡可能提高其提取率和純度，同時盡可能去除THC殘留、避免毒性有機溶劑的使用，確保產品的安全性和環保性。熱回流提取法的優點是提取規模容易放大、提取過程容易控制、經濟簡單，缺點是提取不完全;超臨界二氧化碳萃取法提取完全，但設備昂貴、不利于規模放大、且操作復雜、提取成本高。工業化生產一般采用熱回流提取法對CBD進行提取。目前的CBD合成方法里，化學合成面臨成本高、工藝復雜等諸多挑戰，生物合成報道較少，因其具有反應條件溫和、反應專一、非資源依賴、環保等優勢，是一個新的且具有前景的研究方向，值得進一步探索。

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（收稿日期：2021-06-01 編輯：劉 斌）