清香型小曲酒糖化發(fā)酵過程微生物及色譜指標變化規(guī)律研究

呂義俊，孫 齊，郭唐芳，李興森，劉懷臣

（勁牌有限公司，湖北 大冶 435100）

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

材料：糯高粱、粳高粱、發(fā)酵槽車。

儀器設備：勁牌有限公司楓林酒廠車間生產設備。

1.2 實驗方法

分別選取粳高粱生產車間及糯高粱生產車間同一天生產批次，從入箱糖化開始，到發(fā)酵第15 天結束，每天取糖化醅和酒醅樣進行跟蹤檢測，檢測酵母數(shù)、霉菌數(shù)、細菌數(shù)、原酒五大色譜指標（甲醇、乙醛、正丙醇、乙酸乙酯、雜醇油）含量，取樣及檢測方法如下。

取樣方法：糧食糖化完成后，選取糖化箱床中間區(qū)域取上中下層糖化醅進行混合；然后跟蹤該區(qū)域糧食對應的多個發(fā)酵槽車，每天取距表層20～30 cm 高度的酒醅樣品，為了避免取樣進入氧氣對微生物生長的影響，每次取樣后扎緊槽車并換一個區(qū)域進行取樣。取樣后一部分作為微生物計數(shù)樣品，另一部分采用“50 g 樣品+50 mL 無水乙醇”萃取法，先后于搖床30 min、超聲波水浴30 min、離心機12000 r/min 離心10 min，取上清液進行色譜檢測，每個樣品酒醅檢測3個平行樣，如果3個平行樣檢測差別在10 %以內則取均值，大于10 %則取差別較小的2組數(shù)據(jù)的均值。

細菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母數(shù)檢測：采用稀釋涂布平板計數(shù)法，準確稱取10 g 樣品于裝有100 mL 無菌水的250 mL三角瓶中，置于30 ℃，150 r/min恒溫搖床中振蕩15 min，準確吸取1 mL 菌液于裝有9 mL無菌水的試管中稀釋10倍，然后準確吸取1 mL 稀釋菌液，分別接種牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基、YPD 培養(yǎng)基，然后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后數(shù)菌落數(shù)，單位為CFU/g。

GC 分析條件：氣相色譜儀：Focus 8890，色譜柱：INNOWax 30 m×0.53 mm×1 μm。升溫順序為：40 ℃保持5 min，以6 ℃/min 升至70 ℃，再以10 ℃/min 升溫速度升至220 ℃，保持5 min。進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度280 ℃。

2 結果與分析

2.1 霉菌數(shù)量變化

霉菌是清香型小曲中的主要糖化菌類，霉菌主要有根霉、曲霉和毛霉等，為好氧菌。現(xiàn)用小曲中以米根霉為主，其發(fā)育溫度30～35 ℃，最適溫度32 ℃，各類霉菌增殖主要以延伸菌絲的生長為主，產生大量淀粉酶系，提前將一部分淀粉轉化為可發(fā)酵性糖，并供給酵母的生長增殖。由圖1 可知，糯高粱從糧糟混合開始到發(fā)酵2 d 內，霉菌在有氧條件下快速增長繁殖，頂峰為9.70×10CFU/g，此階段主要為霉菌利用酒醅中殘余的氧氣進行糖化和生長，因此霉菌生長迅速，經酒醅溶氧含量檢測顯示，發(fā)酵24～30 h 酒醅中氧氣含量耗盡（詳見圖2），與該結論互相印證；發(fā)酵第3 天霉菌數(shù)量急劇減少，與發(fā)酵第4 天存在較大差異，應為檢測誤差所致；從發(fā)酵第4 天至發(fā)酵15 d，酒醅中霉菌數(shù)量處于緩慢下降趨勢，第15 天霉菌數(shù)量為5.6×10CFU/g；粳高粱從糧糟混合開始到發(fā)酵5 d 內，霉菌快速增長繁殖，頂峰為11.2×10CFU/g，發(fā)酵6 d 起逐漸減少至發(fā)酵15 d 的2.37×10CFU/g。綜合對比，糯高粱糖化醅、入池醅霉菌量較粳高粱高，且前期增殖速度較粳高粱快、到達頂峰時間早，原因有如下兩點：①糯高粱幾乎全為支鏈淀粉，與直鏈淀粉相比易于糊化及糖化；②糯高粱開箱涎水豐富、入池溫度較粳高粱高2～3 ℃，微生物酶活高、代謝速率快。

圖1 霉菌數(shù)量變化趨勢圖

圖2 發(fā)酵過程溶氧變化趨勢圖

2.2 酵母菌數(shù)量變化

酵母菌是清香型小曲中的主要發(fā)酵菌類，釀酒酵母為兼性厭氧菌，氧氣充足時大量增殖（芽殖），氧氣極少或無氧時調節(jié)代謝途徑進行厭氧發(fā)酵，最佳生長溫度為30 ℃左右，溫度越高增殖和衰亡速度越快，不宜超過38 ℃。從圖3 可以看出，糯高粱和粳高粱均在發(fā)酵第1 天有一個短期的增長繁殖、發(fā)酵第6 天達到最高值，其中糯高粱逐步上升，并于發(fā)酵第6 天達到最高值2.49×10CFU/g，然后又逐漸降低至發(fā)酵結束的10數(shù)量級；粳高粱在發(fā)酵2～5 d動態(tài)波動，于發(fā)酵第6、7天達到最高值1.07×10CFU/g。由于實際檢測過程中，酵母菌平板計數(shù)時存在菌落不明顯、多不可計的現(xiàn)象，導致粳高粱數(shù)據(jù)存在較大波動，該折線圖僅可代表酵母菌增長趨勢，而不能準確反應其數(shù)量級，可證明高粱品種特性對酵母增殖影響較大，酵母菌增殖差異是實際生產中粳高粱與糯高粱雜醇油差別較大的主要原因。

圖3 酵母菌數(shù)量變化趨勢圖

2.3 細菌數(shù)量變化

細菌種類繁多，廣泛分布在釀造生產環(huán)境中，部分兼有糖化和發(fā)酵的作用，小曲酒生產由于環(huán)境原因，細菌種類相對偏少，常見的有醋酸菌、乳酸菌和丁酸菌等，在發(fā)酵過程中分別產生乙酸、乳酸和丁酸，適量細菌生長可為小曲酒生香和配糟提酸產生一定好處，過量則會產生危害。從圖4可以看出,糯高粱和粳高粱糖化發(fā)酵過程，均表現(xiàn)為細菌數(shù)量先上升后下降的趨勢。

圖4 細菌數(shù)量變化趨勢圖

2.4 色譜指標變化

2.4.1 乙醛

小曲白酒中乙醛主要是酵母菌在EMP 途徑中產生，由葡萄糖酵解生成的丙酮酸脫羧而成，為乙醇的前體物質。從圖5 可以看出，糯高粱和粳高粱在發(fā)酵第1～2 天時乙醛有大幅度升高，此過程為葡萄糖大量酵解產生的丙酮酸脫羧生成乙醛造成，化學反應式：CHO→2CHCOCOOH+4[H]+ATP→2CHCHO+2CO；第3～4天降低至最低值,此過程為酵母的無氧發(fā)酵開始,乙醛在乙醇脫氫酶的作用下被快速還原為乙醇；而后乙醛整體呈緩慢上升趨勢，其生成途徑為由酒精氧化而成，化學反應式：2CHOH+O→2CHCHO+2HO，發(fā)酵槽車薄膜松動導致內部（尤其是表層）有少量空氣進入，導致此途徑的發(fā)生。

圖5 乙醛含量變化趨勢圖

2.4.2 甲醇

小曲白酒中的甲醇是由植物原材料表皮中的果膠質在加熱蒸煮過程或者酶的作用下水解生成的甲氧基還原而成的，糖化及發(fā)酵過程酒曲中的黑曲霉產生的果膠酶會促進果膠質的水解。從圖6可以看出，糯高粱、粳高粱糖化醅中甲醇含量較高，說明在經過高溫蒸煮后，糖化過程甲醇含量已達到頂峰；在整個發(fā)酵過程中,甲醇含量整體呈輕微下降趨勢。糯高粱甲醇含量整體略高于粳高粱，與車間實際大生產數(shù)據(jù)較吻合。

圖6 甲醇含量變化趨勢圖

2.4.3 正丙醇

小曲白酒中正丙醇主要是在酵母菌的糖厭氧發(fā)酵過程中作為副產物產生的，酵母菌的衰亡也會產生正丙醇。從圖7 可以看出，糯高粱、粳高粱糖化醅中正丙醇含量較高，而糧糟混合后數(shù)據(jù)下降較大，說明糖化過程會產生一定量正丙醇，且正丙醇主要存在于糧食之中，在配糟中含量較少，糧糟混合后相當于稀釋了糖化醅中的正丙醇含量；發(fā)酵過程整體呈緩慢上升趨勢，與楓林酒廠實際生產中發(fā)酵期延長正丙醇含量也相應升高規(guī)律相符。

圖7 正丙醇含量變化趨勢圖

2.4.4 乙酸乙酯

小曲白酒中乙酸乙酯的生成原理為乙醇丙酮酸在生物酶的作用下生成乙酰輔酶A，然后在酵母、細菌產生分泌的酯化酶作用下與酒精生成乙酸乙酯。從圖8 可以看出，糖化醅中乙酸乙酯含量遠高于糧糟混合，說明乙酸乙酯主要存在于糧食之中，配糟中含量較少，糖化過程也會產生少量乙酸乙酯。兩個品種高粱有共同的規(guī)律：發(fā)酵前11 d 乙酸乙酯呈緩慢上升趨勢；發(fā)酵11～15 d 乙酸乙酯含量上升加快，尤其是粳高粱上升幅度較大，這與“乙酸乙酯多由發(fā)酵后期細菌產生”的釀造機理相吻合。

圖8 乙酸乙酯含量變化趨勢圖

2.4.5 雜醇油小曲白酒中雜醇油的主要生成途徑為酵母菌利用糖及氨基酸合成自身所需蛋白質過程中產生，即合成代謝。從圖9 可以看出，糯高粱和粳高粱雜醇油變化趨勢基本一致,發(fā)酵1～6 d 快速上升，發(fā)酵第7 天出現(xiàn)最大峰值，發(fā)酵8～15 d 回落并趨于平穩(wěn)，與楓林酒廠實際生產數(shù)據(jù)較吻合。結合酵母菌數(shù)量變化趨勢圖3，粳高粱與糯高粱酵母菌含量均在發(fā)酵第6～7 天達到峰值，此過程酵母菌利用糖及氨基酸合成自身所需蛋白質，雜醇油為過程產物，因此雜醇油也隨之達到峰值，進一步驗證了該結論的科學性。

圖9 雜醇油含量變化趨勢圖

3 結論

3.1 通過對整個糖化、發(fā)酵過程酒醅的微生物含量跟蹤檢測，得到了霉菌、酵母及細菌的生長繁殖規(guī)律，均表現(xiàn)為發(fā)酵前期快速增長，發(fā)酵后期緩慢下降的趨勢。

3.2 通過浸提離心及色譜檢測，得到了五大色譜指標的生成規(guī)律：乙醛表現(xiàn)為發(fā)酵前期快速上升，中期下降，后期上升的趨勢；甲醇表現(xiàn)為糖化過程已到峰值，發(fā)酵過程逐漸下降的趨勢；正丙醇、乙酸乙酯均表現(xiàn)為發(fā)酵過程緩慢上升的趨勢；雜醇油表現(xiàn)為發(fā)酵前中期緩慢上升的趨勢，達到峰值時間與酵母菌含量達到峰值時間一致，發(fā)酵后期呈現(xiàn)緩慢下降趨勢。其中雜醇油與酵母菌達到峰值的時間高度一致，印證了結論“雜醇油的主要生成途徑為酵母菌利用糖及氨基酸合成自身所需蛋白質過程中產生”的準確性。

3.3 該報告所提煉的小曲白酒糖化發(fā)酵過程的微生物、五大色譜指標的變化規(guī)律及其關聯(lián)性，對楓林酒廠小曲酒色譜指標控制起到了重要的參考作用。